Лада х рей то 1 цена: LADA XRAY кроссовер от 620 910 руб. – Цены и комплектации – Официальный сайт LADA

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) оценивается как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) по сравнению с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, J (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от изменений J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжает оставаться в силе. несколько спорным.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора посредством вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению расчетного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате κ . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ — в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D), и θ (A), — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донор-акцептор надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимуму, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).Как правило, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), связанной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, близкими к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, позволяющая наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. Ячейки используют стандартное освещение светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией для выявления пространственного расположения флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа прикреплена стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального излучения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Концентрации донорных и акцепторных флуорофоров необходимо тщательно контролировать. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух величин, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным тушением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение эмиссии донора (рисунок 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль эмиссии акцептора (рисунок 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые потенциально могут повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания акцепторной молекулы.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая испускания донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся состоянии, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит из-за того, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную от импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями флуоресцентного резонансного переноса энергии являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни донора в возбужденном состоянии, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в том, что касается методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают повысить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers and Michael W.Davidson — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

3 пункта цены на опции цифрового рентгеновского оборудования

Каждый день наша команда разговаривает с желающими добавить цифровую рентгеновскую систему к своему стабильному оборудованию, но по определенной цене. Хорошая новость для них заключается в том, что существует несколько способов перехода на цифровые технологии, и каждый из них требует разного бюджета.

Ниже мы расскажем о трех вариантах цифрового рентгеновского снимка, которые помогут вам составить представление о том, что лучше всего подходит для следующего решения вашего учреждения.

Хотите опробовать плоский цифровой извещатель на собственном предприятии? Щелкните здесь, чтобы запланировать бесплатную демонстрацию на сайте!

По нашему опыту работы с покупателями рентгеновских снимков с различными потребностями и бюджетами, этот вариант зачастую является наиболее экономичным. Детекторы с плоской панелью DR работают с любой рентгеновской системой , они устраняют кассеты, улучшают качество изображения и получают и визуализируют изображения за секунды.

DR также доступны в нескольких стилях:

Стационарные извещатели: В этой конфигурации извещатель устанавливается в грудную стойку существующей системы. Это может быть отличным вариантом для кабинетов хиропрактики рентгеновских снимков или в сочетании со вторым детектором, который остается в лотке стола. Такая установка с двумя детекторами избавляет от необходимости менять детектор между процедурами.

Привязанные извещатели: В этой конфигурации извещатель перемещается между подставкой для груди и столом.Он связывается с рабочей станцией с помощью одного кабеля. Этот вариант хорошо подходит для помещений с низким или средним объемом, где необходимость в перемещении детектора относительно минимальна.

Беспроводные извещатели: Эти извещатели питаются от батареи и обмениваются данными с рабочей станцией без кабелей. Детектор может свободно перемещаться между подставкой для груди и столом и даже использоваться с другим рентгеновским оборудованием в помещении. Беспроводная связь хорошо подходит для средних и крупных предприятий или учреждений, которые также имеют портативные рентгеновские системы.

В то время как другое оборудование, которое мы здесь обсудим, предлагает более надежные варианты для улучшения рабочего процесса и удовлетворения еще более высоких требований к объему, потребности большинства предприятий могут быть удовлетворены с помощью систем этой ценовой категории.

Средний диапазон цен: 50 000–85 000 долларов США (цены зависят от производителя и возраста системы)

С точки зрения функций, управления объемом пациентов и конфигурации оборудование в этой ценовой категории практически не отличается от предыдущего.Оба они доукомплектованы одинаковыми панелями DR. Разница в том, что сама рентгеновская система никогда не устанавливалась и не использовалась с пациентами. Бывшая в употреблении рентгеновская система, которая была должным образом отремонтирована, не будет работать иначе, чем новая система, но если цена подходящая и оборудование сопоставимо, новая — это хорошо. В зависимости от того, что доступно на рынке подержанных товаров, когда вы начинаете делать покупки, и от того, какой тип гарантийного покрытия вы выберете, есть большая вероятность, что ваша стоимость будет перекрывать цены в первом варианте.

Средний диапазон цен: 60 000–95 000 долларов США (цены зависят от производителя)

На другом конце спектра находится заводская установка для цифровой радиографии (DR). Это, безусловно, самый дорогой способ перехода на цифровые технологии. Они предлагают большие преимущества перед CR с точки зрения времени обработки изображений. Кассеты не используются, а время между получением изображения и цифровым рендерингом на рабочей станции составляет считанные секунды.

Качество изображения и время получения сопоставимы между заводскими системами DR и аналоговыми системами, оснащенными панелями DR. Основное преимущество заводской системы перед модернизацией заключается в том, что многие модели оснащены автоматическими перемещениями, которые могут дополнительно оптимизировать общую эффективность рентгеновского кабинета при максимально быстром перемещении пациентов. довольно большой объем пациента.

Примеры: Fuji Velocity, GE XR656 (на фото справа), GE Definium 8000, Siemens Ysio

Средний диапазон цен: 95 000–150 000 долл. США бывшие в употреблении, 160 000–300 000 долл. США новые

Вывод

Когда вы будете готовы к разработке следующего цифрового рентгеновского решения, вы, конечно же, не будете ограничены ни одним вариантом.Независимо от того, склоняются ли ваши потребности и бюджет к новым, подержанным или собственным цифровым системам, есть решение, которое может по доступной цене вывести ваши рентгеновские возможности на новый уровень.

Если вы хотите начать разговор сегодня, вы можете связаться с нашими специалистами по рентгеновской продукции, чтобы обсудить варианты, или запросить бесплатную демонстрацию на месте панели DR на вашем предприятии.

Если вы хотите узнать больше обо всех вариантах самостоятельно, вы можете воспользоваться любым из наших других бесплатных ресурсов:

• Руководство по ценам на панели DR

• Новые вырезки из CMS Hit CR

• CR Reader vs.Панель DR: Гонка на время [ВИДЕО]

• GE Definium 8000 по сравнению с Proteus с цифровым детектором: стоимость владения

Обзор оптической молекулярной визуализации in vivo и зондирования с помощью рентгеновского возбуждения

1.

Введение

Оптическое молекулярное изображение и зондирование с помощью рентгеновского излучения Лучевое возбуждение использует принципиально другой тип взаимодействия и подход к восприятию для возбуждения оптических репортеров в биологических тканях, а также обнаружения и локализации излучения. Биологическая полезность и цели рентгеновского зондирования для лучшего понимания физиологии и патофизиологии тканей являются движущими мотивами, лежащими в основе технических достижений в этой области.Основными преимуществами рентгеновского излучения в качестве источника возбуждения зонда являются (i) высокая проницаемость и (ii) широкая доступность и признание источников рентгеновского излучения в биомедицинской визуализации. По сравнению с другими методами молекулярного зондирования в ткани сильные стороны молекулярного зондирования на основе рентгеновских лучей могут быть менее очевидными, поскольку эта методология начала появляться только в последнее десятилетие. ^{1 — 3} Тем не менее, способность чувствовать сквозь ткань с использованием традиционных источников рентгеновского излучения при одновременном использовании оптического молекулярного контраста дает потенциальные преимущества в отношении проницаемости по глубине и пространственного разрешения.Оптическое зондирование обеспечивает превосходную молекулярную чувствительность по сравнению с методами контрастирования на основе рентгеновских лучей, поскольку контраст рентгеновских лучей обычно основан на фотоэлектрическом эффекте с пиковым ослаблением в диапазоне энергий кэВ, ⁴ и рентгеноконтрастных агентов присутствуют в тканях в больших количествах, близких к миллимолярным, что делает их полезными только для визуализации объема и утечки крови. Область молекулярного зондирования на основе рентгеновских лучей выигрывает от чрезвычайно большого диапазона детекторов и сенсоров для оптического излучения, которые имеют чувствительность к уровню одиночных фотонов, что делает детекторную сторону отбора проб потенциально очень эффективной.

Возможно, наиболее привлекательной с научной точки зрения частью этой методологии является концепция использования одного источника излучения (например, рентгеновских лучей) в качестве возбуждающего зонда в сочетании с другим типом излучения в качестве сигнала. Эта концептуальная основа для разработки гибридного метода визуализации проиллюстрирована на рис. 1 для нескольких возможных типов излучения. Проиллюстрированы рентгеновские активации с испусканием через пути, которые можно обнаружить через ткань, включая (а) индуцированную рентгеновскими лучами флуоресценцию, (б) индуцированную рентгеновскими лучами оптическую люминесценцию (в центре внимания этого обзора), (в) рентгеновское излучение. электромагнитная индукция, индуцированная лучами, и (d) акустика, индуцированная рентгеновскими лучами.Хотя не все эти подходы подробно рассматриваются здесь, идеальные характеристики такого гибридного метода включают:

• i. уникальный молекулярный зонд, способный с высокой аффинностью связываться с биологическими мишенями;

• ii. высокая контрастность или специфичность за счет высокого отношения сигнал / фон;

• iii. тип сигнала излучения, который может быть обнаружен с высоким отношением сигнал / шум; и

• iv. возбуждающее излучение с высокой проницаемостью для визуализации через ткань (1 / μ≈d, где μ — экспоненциальный коэффициент ослабления, а d — толщина ткани).

Типы сигналов излучения показаны на рис. 1, а значения затухания показаны на рис. 1 (e) и 1 (f).

Рис. 1

Схема различных схем обнаружения для зондов, включая (а) XRF, где рентгеновские лучи являются как возбуждением, так и испусканием, (b) рентгеновская оптическая люминесценция, где выходной сигнал излучения является оптическим от любой сцинтилляции или черенковские процессы, (c) рентгеновская электромагнитная индукция, когда в ткани индуцируется либо ядерный момент, либо электромагнитное изменение, так что выходной сигнал представляет собой радиочастотный сигнал, и (d) рентгеновский акустический сигнал, когда выходной сигнал индуцируется локализованным нагрев, вызывающий переходный процесс ультразвука.Как показано ниже, на (e) спектр ослабления в воде показан для электромагнитного излучения, а на (f) показан спектр ослабления акустических частот в ткани.

В случае оптического излучения самая большая привлекательность состоит в том, что оптические молекулярные зонды составляют, возможно, наиболее развитую и разнообразную группу датчиков для получения изображений биологических объектов. Существуют тысячи оптических датчиков, и некоторые из них коммерчески доступны для использования в доклинической визуализации. Следовательно, доклинические оптические системы визуализации являются наиболее широко используемыми для визуализации всего тела животных, ⁵ , а визуализация функции и патологии тканей с помощью многих типов оптических пятен широко используется как in vivo, , так и ex vivo .Вторая важная особенность обнаружения оптического излучения — очень высокая чувствительность вплоть до уровня одиночных фотонов. Однако из-за рассеяния и поглощения тканями происходит экспоненциальное затухание оптических сигналов с глубиной в ткани, хотя возможно получение изображений через несколько сантиметров ткани. Комбинация возбуждения сканирующим рентгеновским излучением с обнаружением оптического излучения может обойти ограничения разрешения диффузной оптической визуализации, обладая преимуществом оптической чувствительности и широкого выбора агентов оптической визуализации.В качестве альтернативы, комбинации оптического зондирования с другими инструментами структурной визуализации, такими как ультразвук, МРТ или компьютерная томография (КТ), также являются коммерчески доступной парадигмой.

Выбор источников рентгеновского излучения, типов и режимов детекторов также весьма разнообразен. Энергетический диапазон необходимых рентгеновских лучей зависит от типа зонда и механизмов его физического взаимодействия, как показано на рис. 2. Механизмы взаимодействия варьируются от рентгеновских лучей с низкой энергией кэВ, где взаимодействие с зондом осуществляется через фотоэлектрический эффект. , вплоть до низких энергий МэВ, где генерация черенковского излучения является доминирующей модой для возбуждения зонда.В целом, необходимо рассмотреть следующие варианты: (i) источник рентгеновского излучения, (ii) молекулярный зонд, (iii) детектор излучения и (iv) методика восстановления изображения. Эти темы рассматриваются следующим образом, с акцентом на преимущества и недостатки существующих подходов и на то, как вышеупомянутые варианты взаимосвязаны. По мере развития технологий необходимо думать о мотивации, движущих факторах и возможностях. Этот обзор начинается с исторического обзора от истоков методов рентгеновской флуоресценции (XRF) до методов рентгеновской оптической люминесценции с акцентом на молекулярную чувствительность и полезность, а затем заканчивается акцентом на том, что необходимо для развития этой области. возможности.

Рис. 2

Иллюстрация четырех основных категорий зондов, возможных с возбуждением рентгеновскими лучами, грубо разделенных на категории с точки зрения их возможностей (верхняя полоса) прямого возбуждения рентгеновским излучением или вторичного черенковского излучения и (нижняя полоса) по их эмиссионные способности переходят от XRF к рентгеновской люминесценции. Каждая категория имеет как молекулярную (верхний ряд), так и наночастицы (нижний ряд) формы, которые активны в рентгеновских лучах.

2.

Рентгеновская флуоресценция в рентгеновскую оптическую люминесценцию

Основные принципы использования рентгеновских лучей для образцов тканей восходят к успешным истокам XRF-зондирования, где концентрация следов металлов, таких как Fe, Zn, Cu, Hg и Se количественно определяются в ткани путем обнаружения вторичных характеристических рентгеновских лучей, испускаемых при облучении образца возбуждением падающими рентгеновскими лучами или гамма-лучами. ^{6 — 8} В этом случае слово «флуоресценция» используется для обозначения излучения этих специфических рентгеновских лучей с узкими энергетическими полосами, характерными для переходов внутренней электронной оболочки металлов. Фактическое взаимодействие между рентгеновским лучом и фоновой средой приводит к преобладанию рассеянных Комптоном фотонов, которые вносят основной вклад в фон. XRF-визуализация также была разработана как компьютерная томография, ^{9 — 12} и в последнее время широко разработана как инструмент микроскопии для получения изображений микроэлементов на срезах тканей. ¹³ Одна из самых поразительных особенностей XRF заключается в том, что, несмотря на высокую специфичность к металлам, чувствительность низка по сравнению с большинством инструментов молекулярной визуализации in vivo . Пределы обнаружения составляют около 0,1 мг / г, что приближает его к высокому миллимолярному диапазону чувствительности, в то время как для сравнения методы флуоресценции и ядерной медицины имеют концентрационную чувствительность от наномолярного до пикомолярного. ⁸ Как и в случае с оптическими методами, чувствительность в тонких тканях может быть значительно выше, чем при использовании in vivo . ^{14 , 15} Проблемами, ограничивающими обнаружение в XRF, являются (i) высокий фон от комптоновского рассеяния, (ii) высокий шум детектора и (iii) низкая эффективность захвата сигналов детектором. Зондирование тканей и визуализация почти требуют использования моноэнергетических гамма-лучей или источников синхротронного рентгеновского излучения для подавления неспецифического фона и достижения более высокого отношения сигнал / шум. ^{16 , 17} Сила синхротронного подхода заключается в том, что фон низкий и большинство более сильных эмиссионных линий четко отделены друг от друга.

С тех пор, как в течение нескольких десятилетий возник XRF, захватывающим направлением развития было использование других режимов возбуждения или других излучаемых сигналов, которые могли бы обеспечивать молекулярно-специфические сигналы. Кроме того, эти разработки могут обеспечить более широкий диапазон доступных сигналов ¹⁸ при переходе от строго рентгеноконтрастных агентов к другим режимам возбуждения радиолюминесценции. Это проиллюстрировано на рис. 2. Для любого агента-зонда, будь то молекула или наночастица, молекулярная специфичность может быть получена одним из двух способов, либо непосредственно путем зондирования самого атома / молекулы / наночастицы, которая где-то локализуется, либо путем использования специфичности молекулярной мишени, где видимый сигнал XRF исходит от метки на молекуле-носителе.Хотя некоторые атомы металлов могут быть отличными метками, более высокие уровни сигнала могут быть достигнуты за счет использования наночастиц с более высоким поперечным сечением на частицу. Но в более общем плане этот переход влечет за собой необходимость исследовать, какие типы молекул или молекулярных комплексов будут обеспечивать достаточный или лучший сигнал от возбуждения рентгеновскими лучами, а также какие типы излучения могут обеспечить максимальную излучательную способность ткани для обнаружения с высоким отношением сигнал / шум. .

Тогда естественным переходом будет использование более чувствительного режима детектирования, который может достигать уровня одиночных фотонов, такого как либо изотопное гамма-излучение в ядерной медицине, либо методы оптической люминесценции, такие как флуоресценция или фосфоресценция, для увеличения уровня сигнала и / или или подавить фон и уровни шума. ¹⁸ Чтобы сохранить проникновение в ткани, ранние попытки исследовали рентгеновское люминесцентное изображение от люминофоров, излучающих от красного до инфракрасного, поскольку это окно длин волн имеет высокое пропускание через ткань, хотя и со значительным диффузным рассеянием. Другими окнами излучения могут быть электромагнитные области от ГГц до МГц, которые имеют исключительно низкое затухание, хотя это еще предстоит полностью изучить. В качестве альтернативы можно использовать акустическую эмиссию, которая широко применяется в фотоакустике.Эта область называется рентгеноакустической визуализацией или радиоакустикой. ^{19 — 23} Эти режимы измерения взаимодействия рентгеновских лучей показаны на рис. 2, причем схема падающего излучения и обнаружения вверху, а физический режим контраста — внизу. Интересно, хотя и сложно, сравнивать чувствительность обнаружения для каждого из этих четырех возможных режимов обнаружения, потому что диапазон взаимодействий и диапазон детекторов очень разнообразны. Чувствительность к взаимодействию для рентгеновской акустики обычно низкая, поскольку общее количество энергии, выделяемой дозой излучения в ткани, невелико.Однако ультразвуковые преобразователи прекрасно разработаны и обладают высокой чувствительностью, поэтому некоторые предварительные исследования показали, что такой режим обнаружения возможен. Тем не менее, чувствительность обнаружения флуоресцентного излучения может быть на порядки выше, чем акустического обнаружения в условиях биологической визуализации, из-за способности детекторов улавливать одиночные кванты излучения в оптике. Но геометрия и конструкция любой системы обнаружения могут на порядки изменить эту чувствительность.

Режим возбуждения оптически активного контрастного вещества зависит от механизма взаимодействия с излучением, как показано на рис. 2, и энергетического спектра источника излучения. В то время как синхротронные или изотопные источники могут генерировать моноэнергетические пучки рентгеновских лучей или гамма-лучей, наиболее эффективные практические источники рентгеновского излучения основаны на тормозном эффекте электронного луча, падающего на цель, создавая источник широкого спектра, как показано на Рис. 3 (а) и 3 (б).Лишь небольшая часть энергии испускается в виде рентгеновских лучей, а спектр сильно взвешен по фотонам с наименьшей энергией. Таким образом, возбуждение пучка от традиционных источников рентгеновского излучения с широким энергетическим спектром мало специфично. Основными режимами возбуждения, как показано на рис. 3 (c), являются:

• 1. Прямое или косвенное электронное возбуждение сцинтиллятора через верхние синглетные состояния пи-электронов, что в конечном итоге приводит к радиационному распаду. Сложность процессов зависит от природы как среды, так и сцинтиллятора, которая определяет их взаимодействие.Конечные продукты гидролиза воды (то есть H *, HO *, OH-, h4O +, h3 и h3O2) доминируют во взаимодействиях, поскольку вода находится в наибольшей концентрации, и они могут передавать энергию сцинтиллятору. Хорошо известным примером этого является хинин, который, по-видимому, проявляет как сцинтилляцию, так и флуоресценцию; однако взаимодействие со средой, как правило, является доминирующим фактором в этой индукции.

• 2. Мягкие столкновения электронов в среде, приводящие к черенковскому излучению как часть процессов мягких столкновений, которые возбуждают молекулы за счет прямого поглощения синглетного состояния.Это пропорционально показателю преломления среды для черенковского излучения, а затем перекрытию черенковского спектра с поглощением молекул. Почти все молекулы с полосой поглощения в видимом диапазоне с высоким выходом излучения будут работать для этого метода, хотя красные поглощающие молекулы более значимы из-за синего поглощения черенкова кровью в тканях.

Рис. 3

Энергетические спектры рентгеновского излучения от тормозного излучения через линейный ускоритель (a) для разных энергий и спектр для 6 МВ при разных диаметрах пучка (b), показывающий более высокие энергии при меньших пучках.Схема процессов от рентгеновского излучения до оптического излучения показана на (c) либо с прямым сцинтилляцией молекулы, опосредованной различными радиолитическими событиями в среде, либо с непрямым переносом последовательностью фотоэлектрических или комптоновских испускаемых электронов, генерирующих черенковский свет. , который затем дает оптические фотоны, поглощаемые молекулой. Каскад, индуцированный излучением, проиллюстрирован на (d) серией событий взаимодействия между вторичными электронами и фотонами, ведущих к широким механизмам диссипации энергии в среде.

Общая эффективность обоих этих режимов обычно низкая, хотя молекулы с высоким квантовым выходом излучения, такие как флуоресцеин, могут сделать этот процесс более благоприятным. Возникающий каскад излучения, рис. 3 (d), приводит к широкому спектру механизмов взаимодействия, которые могут еще больше снизить эффективность любого отдельного пути. Тем не менее, энергия одиночного рентгеновского фотона (1 МВ) в 106 раз выше, чем у оптического фотона (1 эВ), что указывает на то, что даже небольшой процесс эффективности может привести к десяткам или сотням оптических фотонов на рентгеновский фотон.

3.

Рентгеновская оптическая томография

Рентгеновская люминесцентная томография была впервые постулирована в 2010 году, показав, что радиолюминесцентные частицы можно визуализировать изнутри тканевых фантомов путем сканирования рентгеновских лучей для их возбуждения и регистрации излучения сигнала. ^{4 , 24} Это было расширено, чтобы включить моделирование диффузного переноса света с учетом потери сигнала как функции расстояния между местом излучения и обнаружением света на поверхности.Использование частичного угла для визуализации почти необходимо для этого типа работы, и несколько групп продемонстрировали, как это может быть достигнуто на фантомах ^{25 — 29} и in vivo . ^{30 , 31} Основным ограничением в этом аспекте работы была чувствительность к главным образом используемым наносцинтилляторам. Исследованные механизмы взаимодействия в основном связаны с прямым возбуждением частицы пучком рентгеновских лучей, где зависимость от фотоэлектрического эффекта требует использования материалов с высоким атомным номером, Z, и в основном кристаллических структур для получения достаточного выхода радиолюминесценции из процесс (см. рис.2). Эффективность существенно зависит от энергии рентгеновского излучения E, используемого из-за сильной зависимости сечения взаимодействия фотоэлектрического эффекта с энергией, составляющей σ≈Z4 / E3.

По сравнению с прямым взаимодействием рентгеновских лучей, процесс черенковской радиолюминесценции обеспечивает вторичный механизм возбуждения. Преимущество использования черенкова заключается в том, что он создается во всем объеме, пропорциональном дозе, и обеспечивает широкополосный сине-белый источник света в ткани.Хотя слабым местом является то, что он производится только из вторичных электронов с энергией выше порогового значения 220 кэВ в ткани и с выходом около 1% от общей доставленной дозы. Таким образом, хотя у этого возбуждения есть привлекательные оптические особенности, оно требует источников рентгеновского излучения высокой энергии и все же дает ограниченный световой поток. Тем не менее, черенковская люминесцентная визуализация была продемонстрирована с использованием изотопов in vivo , а также с помощью линейных ускорителей, используемых в лучевой терапии. Последний обеспечивает способ изображения ткани с более высокой точностью благодаря способности сканировать луч через ткань и использовать инструменты обработки изображений для восстановления изображений с высоким разрешением.Основное преимущество этого подхода заключается в том, что флуоресцентное и фосфоресцентное возбуждение может быть достигнуто непосредственно путем поглощения черенковского света молекулярным зондом. Эти молекулярные зонды меньше по размеру, и многие из них могут быть биосовместимыми, как обсуждается ниже.

4.

Источники рентгеновского излучения, пучки и проектирование систем

4.1.

Источники рентгеновского излучения и управление пучком

Одним из ключевых значений молекулярного зондирования на основе рентгеновского излучения является концепция, согласно которой положение источника возбуждения известно априори и может использоваться в процессе реконструкции изображения. так что даже если излучение размывается из-за оптического рассеяния через ткань, может быть восстановлено изображение с высокой точностью.Первоначально это было продемонстрировано в рентгеновской оптической люминесцентной томографии Pratx et al., ³ с использованием рентгеновской визуализации кэВ и реконструкции изображений. Моделирование диффузии может использоваться для уменьшения ошибок, связанных с интенсивностью излучения люминесценции, уменьшающейся при распространении ткани. Используемая геометрия непосредственно соответствует геометрии, доступной для рентгеновской компьютерной томографии, потому что на ее основе основана технология источника. В диапазоне энергий кэВ возможны лучи с линейным сканированием или томография с частичным углом, ^{12 , 29 , 32} и в пучках фотонов МВ от линейных ускорителей, многолепестковых коллиматоров (MLC) и зажимов доступны для динамической формы балок. ³³ Полноэкранное изображение также может работать, хотя и без значительного осевого разрешения из-за оптического рассеяния в ткани, но обеспечивает очевидное высокое разрешение при боковом изображении поверхности ткани. ³⁴

4.2.

Temporal Acquisition

Первые исследования индуцированной рентгеновскими лучами оптической люминесценции, основанной на сцинтилляции, не были получены во временной выборке, потому что источники рентгеновского излучения были непрерывными, и поэтому временная выборка не имела внутренней ценности.Однако в построении изображений люминесцентного излучения с черенковским возбуждением есть как неотъемлемая ценность в удалении фонового черенковского света возбуждения, так и преимущество детектирования с синхронизацией с импульсным источником рентгеновского излучения. Линейные ускорители, производимые для клинического использования, чаще всего имеют сгустки импульсных электронов, которые ускоряются короткими импульсами длительностью 3–5 мс с низкой частотой повторения около 100–400 Гц. Этот отбор образцов значительно медленнее, чем для флуоресценции с временным разрешением, но подходит для методов фосфоресценции с временным разрешением, и поэтому первые демонстрации in vivo были сосредоточены на отображении люминесценции от кислородных датчиков, которые имеют триплетные состояния, которые гасятся в этой временной шкале.Однако существуют более быстрые импульсные источники рентгеновского излучения, такие как небольшие источники рентгеновского излучения для портативных рентгеновских лучей ²⁰ или даже большие источники, используемые для промышленной импульсной радиографии. ³⁵ Самые быстрые коммерчески доступные источники импульсного рентгеновского излучения имеют длину импульса в диапазоне десятков наносекунд, а полнота спада обычно не охарактеризована или не указана. Таким образом, быстрое временное стробирование для таких вещей, как флуоресценция органических молекул, со временем жизни обычно в наносекундном диапазоне, потребует деконволюции для функции отклика прибора рентгеновского детектора, ^{36 , 37} , как это обычно делается. в работе по счёту одиночных фотонов с временной корреляцией. ³⁸

Временное стробирование было продемонстрировано с использованием люминесцентного излучения для подавления черенковского светового сигнала и обеспечения почти бесфонового зондирования ткани. Визуализация одного лимфатического узла была продемонстрирована Zhang et al., ³³ с использованием агента, чувствительного к кислороду, и восстановление продолжительности жизни между 22 и 44 мс предоставило возможность определять местное парциальное давление кислорода (pO2). Возможно обнаружение других люминесцентных частиц, и микросферы европия являются коммерчески доступными агентами для связывания с нацеливающими частями, время жизни которых составляет 100 микросекунд. ³⁹ В качестве альтернативы силиконовые наночастицы также имеют длительный срок службы и могут использоваться в качестве генератора световых сигналов с целевой доставкой. ⁴⁰

4.3.

Боковое и осевое пространственное разрешение

Возможно, одной из наиболее неразвитых областей в молекулярном зондировании на основе рентгеновских лучей является управление источником рентгеновского излучения для улучшения пространственного разрешения. Достижения в конформной и адаптивной лучевой терапии привели к усовершенствованию инструментов на линейном ускорителе для управления распределением дозы луча.MLC, присутствующие на выходе линейного ускорителя, достигли очень высокой степени точности, где может быть достигнута миллиметровая точность падения дозы. Такая же точность затем может быть применена там, где поперечная и осевая протяженность пучков используются для регулировки отбора образцов ткани. Как упоминалось выше, поперечное разрешение в значительной степени контролируется MLC и зажимами линейного ускорителя, но осевое разрешение определяется выбором типа излучения луча (электроны, фотоны и протоны) или глубины сканирования луча, как показано на рис.4 (а). Таким образом, линейные контроллеры MLC обеспечивают простой технологический способ формирования лучей для линейного сканирования, точечного сканирования, многоточечного или многострочного сканирования [см. Рис. 4 (a)] или, в более общем смысле, набора ортогональных базисных функций в исходные шаблоны для таких подходов, как сжатое зондирование. ^{41 , 43 , 44}

Рис. иллюстрация того, как MLC могут использоваться для точечного растрового сканирования или многоточечного сканирования.