В обеих: Синонимы «в обеих ситуациях»

AUDIE CORNISH, ВЕДУЩИЙ:

2020 видел увеличение правил, способствующих доступу и удобству для избирателей, отчасти из-за пандемии. А в 2021 году возникнет движение, подпитываемое отклоненными законом заявлениями бывшего президента Трампа о том, что выборы были украдены, чтобы отменить эти правила голосования…

(ЗВУК ИЗ АРХИВНОЙ ЗАПИСИ)

ПРЕЗИДЕНТ ДЖО БИДЕН: Законодатели некоторых штатов хотят усложнить вам процесс голосования. И если вы голосуете, они хотят иметь возможность сказать вам, что ваш голос не учитывается по какой-либо причине, которую они составляют.

КОРНИШ: … И, по словам президента Байдена, делать гораздо больше.

(ЗВУК ИЗ АРХИВНОЙ ЗАПИСИ)

БИДЕН: Только в этом году 17 штатов приняли — не только предложили, но и приняли — 28 новых законов, чтобы американцам было труднее голосовать.

КОРНИШ: В таких местах, как Миннесота, где люди уже проголосовали против программы идентификации избирателя в 2012 году, республиканские законодатели пытаются вернуть эту идею и многие другие в дебаты.

МЭРИ КИФФМЕЙЕР: Когда дело доходит до голосования, вы должны быть уверены, что избиратель — это тот, кем они себя называют, что вы упрощаете голосование, но его трудно обмануть — очень простая концепция.

КОРНИШ: Это Мэри Киффмайер, одна из сторонников законопроекта, бывший госсекретарь Миннесоты и ведущий голос в сенате штата, контролируемом республиканцами.Она не думает, что 86 избирательных дел, которые Дональд Трамп проиграл в судах по всей стране, ни о чем не говорят. Она сосредотачивается на тех, кто упустил технические детали. Между тем, в контролируемом демократами Доме Миннесоты депутат-первокурсник Эмма Гринман провела свой первый год, пытаясь отбросить счета, которые поддерживает Киффмайер …

ЭММА ГРИНМАН: Я думаю, что это одновременно нацелено на группу избирателей, и я думаю, что это также политически мотивировано. Оба эти утверждения верны.

CORNISH:… И предлагает новые, более обширные собственные законопроекты, используя свой опыт в качестве поверенного по избирательным правам. Мы услышим больше от представителя Гринмана через минуту. Но сначала сенатор Киффмайер объясняет, почему она и ее товарищи-республиканцы сосредоточены на законопроектах, которые, по их словам, помогут в обеспечении безопасности избирателей.

КИФФМЕЙЕР: Проблема, стоящая перед нами, заключается в том, были ли бюллетени поданы честно? Был ли им предоставлен правильный объем доступа? Были ли они точны в том, как они их подсчитали? И уважалась ли их конфиденциальность? Итак, это четыре основных принципа любого избирательного законодательства.И задать вопрос — это не фальшивка или что-то еще. Это просто говорит о том, что избиратели заслуживают ответа на эти вопросы. И сам факт постановки вопроса ставится под сомнение. И когда ему бросают вызов, удивляешься, почему они держат все в секрете.

КОРНИШ: В октябре 2020 года судья окружного суда США сказал: «Смотрите; в Миннесоте — мошенничество с избирателями — мы видели два случая из 45 миллионов бюллетеней, поданных с 1979 года. Так что в некотором смысле это кто-то пытается ответить на поставленный вами вопрос.Как вы это слышите? Мол, как вы слышите эти числа? Как вы слышите эти ответы?

КИФФМЕЙЕР: Ну, опять же, в Миннесоте вы должны доказать намерение. Так что на самом деле виновным оказывается только глупый преступник, потому что он был достаточно глуп, чтобы сказать: да, я намеревался совершить мошенничество с избирателями. Любой другой, кто сказал: ну и ну, я не знал, дело обычно закрывают. Ничего не происходит. Итак, судить о достоинствах мошенничества только тех, кто был осужден, не является истинной мерой того, какое мошенничество может иметь место, и это материальный факт.А в прошлом Верховный суд США заявил, что в отношении закона об удостоверениях личности избирателей в Индиане факт мошенничества при голосовании действительно имеет место, и что система правильно защищает других избирателей от случаев мошенничества.

КОРНИШ: На этой неделе президент Байден говорил о законах о голосовании.

(ЗВУК ИЗ АРХИВНОЙ ЗАПИСИ)

БИДЕН: Нападение Джима Кроу в двадцать первом веке реально. Это неумолимо, и мы собираемся решительно бросить ему вызов.

КОРНИШ: Поскольку он говорит о республиканских законопроектах в законодательных собраниях штатов, можете ли вы отреагировать на то, что вы там слышите?

КИФФМЕЙЕР: Что ж, для меня, когда я читал отчеты о различных законопроектах, которые были приняты и подписали закон, я не понимаю, что видит президент Байден. Я этого не вижу. Как будто они используют партизанский довод. Если республиканец принял его или республиканский законодательный орган принял его, это должно быть плохо. Поэтому они не обращаются к существу законопроекта и не смотрят на то, расширяет ли он положение вещей.Они просто говорят, что это республиканец. Это должно быть плохо. Мы должны быть против, потому что они республиканцы — должно быть плохо. Я заметил, что он назвал, сколько счетов было предложено республиканцами, но не сколько было предложено демократами. В штате Миннесота многие из них были приняты демократами, хотя в одном случае им понравились все законы о выборах, которые они выиграли. Но сказать, что это республиканский закон; это должно быть плохо — мальчик, что за партизанское слово.

КОРНИШ: Это интересно.Он не просто говорит, что это плохо; он называет это нападением Джима Кроу 21 века.

КИФФМЕЙЕР: (Смех) Ну, это в лучшем случае гипербола.

CORNISH: Как вы думаете, как ваши избиратели слышат это?

КИФФМЕЙЕР: В моих разговорах с ними, с цветными людьми, по поводу удостоверений личности — это то, что до тех пор, пока у вас одинаковое отношение к избирателям, они в порядке с удостоверениями личности избирателя. В чем проблема? Я имею в виду, что вопрос в том, одинаково ли у вас отношение к избирателям? И на самом деле, если вы дойдете до того, что дадите бесплатный и поможете им с документами поддержки и всем остальным, они не увидят в этом проблемы.

КОРНИШ: Наконец, мы говорим с представителем штата Гринманом, который, очевидно, также выдвинул множество законов. И она сказала, что способ вызвать доверие людей к нашим выборам — это уважать избирателей и говорить правду о том, что это были безопасные и надежные выборы. Согласны ли вы с этим? Как вы относитесь к этому заявлению?

КИФФМЕЙЕР: Это очень общее утверждение, и это утверждение, которое иногда заставляет людей задавать вопрос, откуда вы знаете, что это было безопасно и надежно — просто произнося это на своем слове? У тебя есть доказательства? Позволите ли вы также другим, у кого есть вопросы по этому поводу, задать этот вопрос, не будучи обвиненными в злонамеренном отношении? Что плохого в том, чтобы говорить, давай докажем? Итак, когда вы делаете пересчет, вы можете сказать: вот все бюллетени.Все демократы и республиканцы могут смотреть на эти бюллетени. Могут сосчитать, вместе пересчитать. А когда что-то сделано, это очень открытый, прозрачный процесс. Другие люди говорят, можем ли мы его открыть? Можем ли мы добиться большей прозрачности, чтобы все мы могли пользоваться уверенностью представителя Гринмана в том, что это безопасно и надежно? Что случилось с этим? Что плохого в таком подходе?

CORNISH: сенатор штата Мэри Киффмайер.

Теперь мы задаем ее вопрос демократу и представителю штата Миннесота Эмме Гринман: если она так уверена в том, что выборы безопасны и безопасны, что не так с законодательством, которое могло бы успокоить некоторых людей?

ГРИНМАН: Я думаю, что когда мы говорим о воздержании от обеспокоенности людей — вы не услышите, как я часто цитирую сенатора Ромни, но я скажу, что то, что он сказал в ответ на это, было лучшим способом успокоить людей — это сказать Истина в том, что у нас в Миннесоте действительно сильная избирательная администрация, беспартийная избирательная администрация, управляемая местными избирательными органами, 30 000 наших друзей и соседей.И поэтому я думаю, что обеспокоенность, которую я испытываю по поводу дезинформации и озвучивания ее как опасений, заключается в том, что она на самом деле не основана на фактах и ​​заставляет людей нацеливаться на судей на выборах и должностных лиц на выборах. И поэтому мы слышали, что местные избирательные органы обеспокоены тем, что мы наблюдаем рост запугивания и страха.

CORNISH: Что вы думаете о людях, которые по какой-либо причине, на основании какой-либо информации, которую они получили, действительно обеспокоены выборами? Как вы думаете, умиротворят ли кого-либо из них изменения в законе, то есть есть ли какие-либо положения, ужесточающие правила голосования, которые вы бы поддержали?

GREENMAN: Итак, опять же, я отвергаю предположение о том, что то, что действительно … то, откуда на самом деле возникают эти проблемы, является административным исправлением, которое мы можем иметь.Я думаю, если вы не верите, что выборы 2020 года были свободными и справедливыми, и вы не слушаете демократов, республиканцев, экспертов и администраторов местных выборов, которые говорили это, то мы не ведем разговора о политика.

CORNISH: Когда вы услышали на этой неделе комментарии президента Байдена, в которых законодателей-республиканцев по существу обвиняли в возрождении подхода эпохи Джима Кроу к политике голосования, что вы на это ответили?

ГРИНМАН: Вы знаете, я был в Джорджии в 2018 году и увидел смерть от тысячи сокращений того, насколько сложнее было голосовать в некоторых округах, где преобладали афроамериканцы.Я видел — в 2016 году я был в Аризоне, и я видел нападения на латиноамериканских избирателей, и я видел политический ответ, некоторые из которых попали в Верховный суд. И в Миннесоте я это вижу. И поэтому я думаю, что президент Байден говорит правду, которая не нова в 2020 году, которую мы видели, но я думаю, что это ускорение того, что он назвал подрывной деятельностью на выборах, или действительно преследование не только избирателей, ограничение их доступа и нацеливание на определенные типы избирателей, но также и сам подсчет, и действительно политизация и вмешательство — это в новинку.И мы видим это, и мы видели это в ответ на 2020 год.

CORNISH: Когда вы видите действие, которое, по мнению техасских законодателей, они должны были предпринять, покинув Капитолий, чтобы они могли приостановить, отложить или приостановить принятие законов, — это трюки? Это эскалация? Как вы их видите?

ГРИНМЕН: Я вижу, что мои коллеги в Техасе делали в Палате представителей, используя силу, которую они имели, чтобы противостоять избирателям. Я не думаю, что это был трюк. Я действительно думаю, что теперь, будучи членом Законодательного собрания, знаю, насколько серьезна сделка и насколько серьезно они к ней относятся.

КОРНИШ: Но поскольку у вас разделенное законодательное собрание, это не та ситуация, когда вы, ребята, можете сбежать с места происшествия, если что-то не получается. Я имею в виду, тебе нужно идти на компромисс, верно? И вам уже приходилось делать это с такими вещами, как ящик для голосования.

GREENMAN: Я думаю, что ящик для голосования — хороший пример. Но каков наш аргумент — и у нас есть сила убеждения с миннесотцами, то есть мы должны проводить ту разумную политику, которая укрепляет право голоса в Миннесоте, укрепляет права избирателей.Это не двухпартийный подход; это беспристрастно. Мы должны прислушиваться к нашим местным законодателям. Итак, это работа.

КОРНИШ: Это была представитель штата Миннесота Эмма Гринман. А ранее вы слышали сенатора штата Мэри Киффмайер. Завтра мы услышим мнение двух историков, которые рассуждают о том, как эти законы могут повлиять на будущее демократии.

(ЗВУК ПЕСНИ ПЛЯЖНОГО ДОМА «ЧЕРНАЯ МАШИНА»)

Авторские права © 2021 NPR. Все права защищены. Посетите страницы условий использования и разрешений на нашем веб-сайте www.npr.org для получения дополнительной информации.

стенограмм NPR создаются в срочном порядке Verb8tm, Inc., подрядчиком NPR, и производятся с использованием патентованного процесса транскрипции, разработанного NPR. Этот текст может быть не в окончательной форме и может быть обновлен или изменен в будущем. Точность и доступность могут отличаться. Авторитетной записью программирования NPR является аудиозапись.

Широко распространенная дискриминация продолжает формировать жизнь ЛГБТ как тонкими, так и значительными способами

Чтобы просмотреть более свежие данные и анализ опыта ЛГБТК-людей с дискриминацией, см. «Состояние ЛГБТ-сообщества в 2020 году.”

Национальный опрос проливает свет на то, как дискриминация влияет на ЛГБТК в различных сферах их жизни.

Новое исследование Центра американского прогресса показывает, что ЛГБТ по всей стране продолжают сталкиваться с повсеместной дискриминацией, которая негативно влияет на все аспекты их жизни. В ответ ЛГБТ-люди вносят тонкие, но глубокие изменения в свою повседневную жизнь, чтобы минимизировать риск дискриминации, часто скрывая свое подлинное «я».

Каждый четвертый ЛГБТ сообщил о дискриминации в 2016 году

За последнее десятилетие страна добилась беспрецедентного прогресса в направлении равенства ЛГБТ. Но на сегодняшний день ни у федерального правительства, ни у большинства штатов нет четких статутных законов о недискриминации, защищающих людей по признаку сексуальной ориентации и гендерной идентичности. ЛГБТ-люди по-прежнему сталкиваются с широко распространенной дискриминацией: от 11 до 28 процентов ЛГБ-работников сообщают о том, что они потеряли продвижение по службе просто из-за своей сексуальной ориентации, а 27 процентов трансгендерных работников сообщают, что их уволили, не приняли на работу или отказали в повышении в прошлом году.Дискриминация также обычно затрагивает ЛГБТ-людей вне рабочего места, иногда обходя их домом, доступом к образованию и даже возможностью участвовать в общественной жизни.

Данные национального репрезентативного опроса ЛГБТ, проведенного CAP, показывают, что 25,2% респондентов ЛГБТ подвергались дискриминации из-за своей сексуальной ориентации или гендерной идентичности в прошлом году. Опрос, проведенный в январе 2017 года, показывает, что, несмотря на прогресс, в 2016 году дискриминация оставалась широко распространенной угрозой благополучию, здоровью и экономической безопасности ЛГБТ.

Среди людей, подвергшихся дискриминации по признаку сексуальной ориентации или гендерной идентичности в прошлом году:

• 68,5% сообщили, что дискриминация хотя бы в некоторой степени негативно сказывалась на их психологическом благополучии.
• 43,7% сообщили, что дискриминация отрицательно сказывалась на их физическом самочувствии.
• 47,7% сообщили, что дискриминация негативно сказывалась на их духовном благополучии.
• 38,5% сообщили, что дискриминация негативно сказалась на их школьной среде.
• 52,8% сообщили, что дискриминация негативно сказывалась на их рабочей среде.
• 56,6 сообщают, что это негативно повлияло на их район и среду сообщества.

Невидимый вред

ЛГБТ, которые не сталкиваются с явной дискриминацией, например, увольнением с работы, все же могут обнаружить, что угроза, исходящая от нее, формирует их жизнь тонким, но глубоким образом. Дэвид М. *, гей, работает в компании из списка Fortune 500 с официальной письменной политикой недискриминации.«Меня не могли уволить за то, что я гей, — сказал он. Но Дэвид продолжал объяснять: «Когда партнеры в фирме приглашают гетеросексуалов сквош или выпить, они не приглашают женщин или геев. Меня упускают из-за возможностей, которые могут привести к продвижению по службе «.

«Я пытаюсь свести к минимуму предвзятое отношение к себе, изменяя свое представление о корпоративном мире», — добавил он. «Я понижаю голос на собраниях, чтобы он казался менее женственным, и не ношу ничего, кроме черного костюма. … Когда вас воспринимают как женского человека — будь вы женщина или гей, — вас исключают из отношений, которые улучшают вашу карьеру.”

Дэвид не одинок. Результаты опроса и соответствующие интервью показывают, что ЛГБТ-люди скрывают личные отношения, откладывают медицинское обслуживание, меняют то, как они одеваются, и предпринимают другие шаги, чтобы изменить свою жизнь, потому что они могут подвергнуться дискриминации.

Мария С. *, квир-женщина, живущая в Северной Каролине, описала долгую поездку из дома в Дареме в другой город, где она работает. Она каждый день ездит на машине, чтобы жить в городе, дружественном к ЛГБТ.Она любит свою работу, но не любит своего босса. «Интересно, отпустили бы меня, если бы начальство узнало о моей сексуальности», — говорит она.

CAP показывает, что истории Марии и Дэвида — обычное дело. В приведенной ниже таблице показан процент ЛГБТ, которые сообщают, что изменили свою жизнь различными способами, чтобы избежать дискриминации.

Как показано в Таблице 1, ЛГБТ-люди, подвергшиеся дискриминации в прошлом году, значительно чаще изменяют свою жизнь из-за страха дискриминации, даже решая, где им жить и работать, что предполагает долгосрочные последствия для жертв дискриминации. дискриминация.Тем не менее, результаты также подтверждают утверждение о том, что ЛГБТ-люди не должны подвергаться дискриминации, чтобы действовать таким образом, чтобы помочь им избежать ее, что согласуется с эмпирическими данными по компоненту теории стресса меньшинств: ожиданиям отвержения.

Угроза дискриминации может не только помешать ЛГБТ-людям вести подлинную жизнь, но и лишить их материальных возможностей. Рафаэль Дж. *, Гей-студент из Калифорнии, сказал CAP, что он «решил подавать документы в юридические школы только в городах или штатах, безопасных для ЛГБТ», отказав ему в возможности продолжить свое последипломное образование в школах, в которые он иначе мог бы поступить.«Я не думал, что буду в безопасности, будучи открытым геем, — сказал он. «В некоторых местах особенно цветных геев».

Уникальные уязвимости на рабочем месте

В сообществе ЛГБТ люди, которые были уязвимы перед дискриминацией по разным личностям, сообщили об уникально высоких показателях поведения избегания.

В частности, цветные ЛГБТ с большей вероятностью скрывали свою сексуальную ориентацию и гендерную идентичность от работодателей: в прошлом году 12 процентов удаляли элементы из своих резюме — по сравнению с 8 процентами белых респондентов ЛГБТ.Точно так же 18,7% респондентов ЛГБТ в возрасте от 18 до 24 лет сообщили об удалении пунктов из своих резюме — по сравнению с 7,9% респондентов в возрасте от 35 до 44 лет. Между тем, 15,5% респондентов из числа ЛГБТ-инвалидов сообщили об удалении пунктов из своих резюме — по сравнению с 7,3% среди ЛГБТ-людей, не являющихся инвалидами. Этот вывод может отражать более высокий уровень безработицы среди цветных людей, инвалидов и молодежи; это также может отражать тот факт, что ЛГБТ, которые также могут столкнуться с дискриминацией по признаку расы, молодости и инвалидности, чувствуют себя уникально уязвимыми перед отказом в работе из-за дискриминации или сочетания факторов.

Уникальные уязвимости в сквере

Дискриминация, домогательства и насилие в отношении ЛГБТ, особенно трансгендеров, всегда были обычным явлением в общественных местах, таких как отели, рестораны или правительственные учреждения. Исследование трансгендеров в США в 2015 году показало, что среди трансгендеров, посетивших общественное место проживания, где сотрудники знали или считали, что они трансгендеры, почти каждый третий сталкивался с дискриминацией или преследованием, включая отказ в равных услугах или даже физическое нападение.

В марте 2016 года тогдашний губернатор Пэт МакКрори подписал контракт с H.B. 2 в закон, который санкционировал дискриминацию трансгендеров в учреждениях для разнополых мужчин, и начал беспрецедентную атаку на доступ трансгендеров к общественным помещениям и их способность участвовать в общественной жизни. В том же году в законодательные собрания штатов по всей стране было внесено более 30 законопроектов, специально направленных на доступ трансгендеров к общественным помещениям. В рамках этого опроса у транссексуалов спрашивали, избегали ли они общественных мест с января 2016 года по январь 2017 года во время общенациональной атаки на права трансгендеров.Среди опрошенных трансгендеров:

• 25,7% сообщили, что избегают общественных мест, таких как магазины и рестораны, по сравнению с 9,9% цисгендерных ЛГБ-респондентов
• 10,9% сообщили, что избегают общественного транспорта, по сравнению с 4,1% цисгендерных ЛГБ-респондентов
• 11,9% избегали получения услуг, в которых нуждались они или их семья, по сравнению с 4,4% цисгендерных ЛГБ-респондентов
• 26,7% приняли конкретные решения о том, где делать покупки, против 6.6% цисгендерных ЛГБ-респондентов

Эти данные свидетельствуют о том, что продолжающаяся дискриминация в общественных местах вытесняет трансгендеров из общественной жизни, затрудняя им доступ к ключевым услугам, использование общественного транспорта или просто посещение магазинов или ресторанов без страха дискриминации.

ЛГБТ-люди с ограниченными возможностями также значительно чаще избегали общественных мест, чем их коллеги из числа ЛГБТ, не являющиеся инвалидами. Среди респондентов-инвалидов ЛГБТ в прошлом году:

• 20.4% сообщили, что избегают общественных мест, таких как магазины и рестораны, по сравнению с 9,1% респондентов из числа ЛГБТ без инвалидности
• 8,8% сообщили, что избегают общественного транспорта, по сравнению с 3,6% среди ЛГБТ-респондентов без инвалидности
• 14,7% избегали получения услуг, в которых нуждались они или их семья, по сравнению с 2,9% среди ЛГБТ-респондентов, не являющихся инвалидами
• 25,7% приняли конкретные решения о том, где делать покупки, по сравнению с 15,4% среди ЛГБТ-респондентов, не являющихся инвалидами

Это вероятно потому, что, помимо риска преследований и дискриминации против ЛГБТ, ЛГБТ-люди с ограниченными возможностями борются с недоступными общественными местами.Например, многие транспортные агентства не соблюдают требования Закона об американцах с ограниченными возможностями (ADA), которые сделали бы общественный транспорт доступным для людей с нарушениями зрения и когнитивных способностей.

Уникальные уязвимости в здравоохранении

В 2010 году более половины ЛГБТ сообщили о дискриминации со стороны поставщиков медицинских услуг, а более 25 процентов опрошенных трансгендеров заявили, что им категорически отказали в медицинской помощи. С тех пор ЛГБТ-люди получили защиту от дискриминации в сфере здравоохранения — в частности, положения, вытекающие из Закона о доступном медицинском обслуживании (ACA), запрещают больницам, поставщикам медицинских услуг и страховщикам, финансируемым из федерального бюджета, дискриминировать пациентов из числа ЛГБТ.Несмотря на прогресс, ЛГБТ, и в частности трансгендеры, остаются уязвимыми для дискриминации в сфере здравоохранения: в 2015 году одна треть трансгендеров, обращавшихся к врачу, сообщила «по крайней мере об одном негативном опыте, связанном с трансгендерностью». Эти негативные переживания включали отказ в лечении или даже физическое насилие. Цветные трансгендеры и люди с ограниченными возможностями сообщают об особенно высоких показателях дискриминации со стороны поставщиков медицинских услуг.

Неудивительно, что люди из этих уязвимых групп особенно склонны избегать посещения врача, откладывая как профилактическую, так и необходимую медицинскую помощь:

• 23.5 процентов опрошенных трансгендеров избегали приемов врачей в прошлом году по сравнению с 4,4 процентами цисгендерных респондентов из числа ЛГБ
• 13,7% респондентов из числа ЛГБТ-инвалидов избегали приема врачей в прошлом году по сравнению с 4,2% респондентов из числа ЛГБТ-инвалидов, не являющихся инвалидами
• 10,3% цветных ЛГБТ избегали приемов врачей в прошлом году по сравнению с 4,2% белых ЛГБТ-респондентов

Эти результаты согласуются с исследованием, которое также выявило закономерности дискриминации в области здравоохранения в отношении цветных людей и инвалидов.Например, одно исследование практики здравоохранения в пяти крупных городах показало, что более одной из пяти медицинских учреждений были недоступны для пациентов, которые использовали инвалидные коляски.

Призыв к действию

Чтобы гарантировать, что федеральные законы о гражданских правах прямо защищают ЛГБТ, Конгресс должен принять Закон о равенстве, всеобъемлющий закон, запрещающий дискриминацию по признаку сексуальной ориентации и гендерной идентичности в сфере занятости, общественных помещений, жилья, кредита и федерального финансирования, среди прочего.Аналогичным образом, правительства штатов и местные органы власти должны принять всеобъемлющие меры защиты от дискриминации для всех. Всеобъемлющая защита от дискриминации пользуется большей поддержкой со стороны избирателей, чем когда-либо прежде: большинство в каждом штате страны поддерживает законы о недискриминации.

Хотя комплексные меры защиты от дискриминации не предотвратят все случаи дискриминации, они являются важным способом привлечения к ответственности работодателей и домовладельцев. Кроме того, они посылают сигнал о том, что ЛГБТ-люди принимаются и уважаются на всех уровнях власти.ЛГБТ-люди заслуживают возможности жить полноценной, равной и подлинной жизнью — а это невозможно, пока дискриминация остается угрозой для ЛГБТ-людей и их семей.

Седжал Сингх — менеджер по кампаниям и коммуникациям проекта по исследованиям и коммуникациям ЛГБТ компании American Progress. Лаура Э. Дюрсо — вице-президент проекта исследований и коммуникаций ЛГБТ компании American Progress.

* Примечание авторов: Все имена изменены из уважения к конфиденциальности интервьюируемых.

Методология

Для проведения этого исследования CAP заказала и разработала опрос, проведенный компанией Knowledge Networks, в ходе которого было опрошено 1864 человека об их опыте работы в области медицинского страхования и здравоохранения. Среди респондентов 857 определились как лесбиянки, геи, бисексуалы и / или трансгендеры, а 1007 определились как гетеросексуалы и цисгендеры / нетрансгендеры. Респонденты представляли все диапазоны доходов и различались по таким факторам, как раса, этническая принадлежность, образование, география, инвалидность и возраст.Опрос был проведен онлайн на английском языке в январе 2017 года, что совпало с четвертым периодом открытой регистрации через рынки медицинского страхования и началом первого полного года действия федеральных правил, специально защищающих ЛГБТ-людей от дискриминации в сфере медицинского страхования и медицинского обслуживания. Данные являются репрезентативными на национальном уровне и взвешены в соответствии с характеристиками населения США. Все полученные результаты являются статистически значимыми, если не указано иное. Все представленные сравнения статистически значимы при p <.05 уровень.

Помимо количественного исследования, авторы запросили статьи, исследующие влияние дискриминации на жизнь ЛГБТ. Используя платформы социальных сетей, авторы исследования попросили добровольцев анонимно рассказать о личном опыте изменения своего поведения или внесения других изменений в свою повседневную жизнь, чтобы избежать дискриминации. Интервью проводились одним из авторов исследования, и имена были изменены, чтобы защитить личность респондента.

Дополнительную информацию о методах обучения и материалы можно получить у авторов.

Боль в обоих локтях: причины и лечение

Если вы когда-нибудь ударились о свою забавную кость, вы знаете, что боль в локте может расстраивать. Но из-за того, что в локте задействованы различные мышцы, связки, сухожилия и кости, может быть трудно точно понять, почему ваш локоть болит.

Локоть — это сустав, который соединяет верхнюю руку с нижней. В то время как многочисленные сухожилия и мышцы помогают стабилизировать и защищать ваш локоть, локтевая коллатеральная связка и радиальная коллатеральная связка являются особенно важными частями вашей анатомии.

Если вы повредите одну из этих связок или повредите хрящ в локтевом суставе, вы можете испытать боль в локте. Хотя людям может быть полезно узнать больше о потенциальных причинах боли в локтевом суставе, им следует избегать самодиагностики. Вместо этого эта статья может служить руководством, чтобы вы могли лучше описать свою боль своему врачу.

Анупонг Тхонгчан / EyeEm / Getty Images

Причины

Многие люди будут испытывать боль в одном локте, особенно если они травмировались во время аварии или перенапрягали локоть во время занятий спортом.Олекранонный бурсит — еще одно заболевание, часто поражающее один локоть.

Однако некоторые люди могут чувствовать боль в обоих локтях. Некоторые состояния, в том числе тендинит и артрит, могут вызывать боль в одном или обоих локтях.

Тендинит

Тендинит — это болезненное состояние, которое возникает, когда ваши сухожилия tissues ткани, соединяющие мышцы с костями воспаляются. Хотя тендинит может вызывать ноющие боли в локте или руке, это состояние часто носит временный характер.

У людей может возникнуть тендинит после переутомления локтей, вытирая пол вручную, играя в теннис или выполняя другие задачи, когда они постоянно двигают локтями. Некоторые действия могут привести к воспалению обоих локтей.

Если у вас тендинит, вы почувствуете облегчение, если дадите отдохнуть рукам. Если ваши симптомы не исчезнут после нескольких дней домашнего ухода, подумайте о посещении врача.

Ревматоидный артрит

В отличие от тендинита, артрит — хроническое заболевание.Однако бывают разные типы артрита. Ревматоидный артрит (РА) — это аутоиммунное заболевание, при котором ваша иммунная система атакует ваши суставы. Это состояние может вызвать отек, боль и жесткость в локтях.

RA обычно поражает суставы симметрично, поэтому, если у одного локтя есть симптомы, у другого тоже. Достаточно часто поражается один или оба локтя, от 20% до 65% случаев.

В локтях есть мягкие ткани, которые смягчают и защищают кости. Эти ткани обычно работают как амортизаторы, позволяя суставу двигаться без болезненного трения костей друг о друга.

Если у вас РА, синовиальная оболочка набухает и утолщается. У вас может быть меньший диапазон движений в локтях. Вы также можете ощущать пульсирующую, ноющую или иррадирующую боль, особенно когда вы просыпаетесь утром или если вы долгое время не двигали руками.

Хотя от РА нет лекарства, ваш врач может назначить иммунодепрессанты или противоревматические препараты, модифицирующие болезнь (DMARD). Некоторые люди с легкой или умеренной болью в локтях могут прикладывать тепло или компрессы со льдом, чтобы уменьшить воспаление, вызванное симптомами РА.

Артроз

Остеоартрит — еще одна частая причина хронической боли в локтевом суставе. Как правило, сначала поражается сустав с одной стороны, но может развиться и другой локоть. К сожалению, остеоартрит — хроническое заболевание, которое, как и РА, неизлечимо. Однако есть несколько способов уменьшить боль и предотвратить дальнейшее повреждение суставов.

Если у вас остеоартрит локтей, мягкие ткани между костями начали разрушаться. С возрастом повторяющиеся движения и давление на суставы в конечном итоге могут привести к истощению хрящей в локтях.Без этих мягких тканей для поддержки локтя вы можете почувствовать, что ваша рука жесткая или болит.

Хотя вы, возможно, не сможете восстановить или заменить утраченные ткани локтя, вы можете носить налокотники и выполнять упражнения с малой нагрузкой, чтобы сохранить оставшийся хрящ.

Когда обращаться к врачу

Если вы испытываете боль, вы можете задаться вопросом, когда вам следует обратиться к врачу. Любые боли, нарушающие вашу жизнь, являются потенциальной причиной для беспокойства со стороны врача и могут потребовать посещения врача.В противном случае, если боль в локтевом суставе не уменьшится после нескольких дней лечения в домашних условиях и отдыха, вам следует обратиться за медицинской помощью.

Если вы попали в аварию или получили травму, вызвавшую внезапную или сильную боль в локтевом суставе, обратитесь к врачу. Возможно, вы вывихнули или сломали локоть, и врач может определить серьезность вашей травмы.

Кроме того, если вам уже поставили диагноз артрит, но вы испытываете новые, другие или усиливающиеся боли в локтях, вы можете рассмотреть возможность посещения врача, чтобы справиться с изменяющимися симптомами.

Диагноз

Ваш терапевт или специалист, например ревматолог, могут использовать несколько различных методов для диагностики причины боли в локтевом суставе.

Физический осмотр

Медицинский осмотр может помочь вашему врачу понять, где и почему именно вы болеете. Врач может почувствовать и пошевелить вашим локтем, поворачивая вашу руку, чтобы точно определить опухоль, раздражение или возможные травмы. Они могут попросить вас поднять руки, согнуть локоть или сжать кулаки, чтобы наблюдать за диапазоном ваших движений.

Изображения

Рентгеновская или магнитно-резонансная томография (МРТ) может показать вашему врачу состояние костей в руке, поэтому эти визуализационные тесты особенно полезны при анализе того, может ли проблема со скелетом вызывать боль в локтевом суставе. Визуализирующие обследования могут выявить запущенный остеоартрит или переломы костей.

Лабораторные испытания

После медицинского осмотра ваш врач может решить, что вам будут полезны лабораторные анализы. Анализы крови могут помочь выявить РА или другое аутоиммунное заболевание, инфекцию, рак или другие заболевания, которые могут способствовать возникновению боли в локтевом суставе.

Лечение

Безрецептурные обезболивающие, такие как тайленол (ацетаминофен), являются обычными лекарствами для облегчения боли в локтях. Приложите к локтю холодный или горячий компресс, чтобы уменьшить отек.

Врач может порекомендовать опиоидные препараты, такие как оксикодон или гидрокодон, если у вас запущенная форма артрита или серьезная травма локтя. Используйте опиоиды только по назначению из-за риска зависимости.

Если травма или перенапряжение привели к боли в локте, возможно, вам придется отдохнуть и надеть спортивный бандаж для дополнительной поддержки.Однако если у вас артрит, врач может посоветовать вам больше заниматься физическими упражнениями, чтобы ваши суставы оставались свободными и гибкими, что поможет вам легче двигать руками в будущем.

Если ревматоидный артрит является причиной боли в локтевом суставе, лечение обычно включает иммунодепрессанты или БПВП.

Некоторые пациенты дополняют свой обычный медицинский распорядок альтернативными методами лечения, такими как иглоукалывание. Хотя некоторые исследования показывают положительные результаты для пациентов с артритом, которые регулярно проходят лечение иглоукалыванием, особенно электроакупунктурой, эти методы лечения не предназначены для замены рекомендаций врача или назначенных вами лекарств.

Хотя ни один метод выживания не подойдет всем, многие люди считают, что стратегии, обеспечивающие некоторое облегчение, включают легкие упражнения (йога, плавание, растяжка), тепло или компрессы со льдом и безрецептурные обезболивающие. Поднятие легких тяжестей может помочь укрепить мышцы рук, что защитит вас от напряжения локтей в будущем.

Проконсультируйтесь со своим врачом, чтобы определить план медицинского обслуживания, отвечающий вашим конкретным потребностям.

Слово Verywell

Наши локти помогают нам делать важные вещи, например поднимать детей или внуков, махать соседям, ловить мяч, закрывать дверь или готовить по нашим любимым рецептам.Когда у вас болят локти, вы можете расстроиться, если не можете выполнять многие из этих повседневных задач без дискомфорта.

Хотя существует несколько потенциальных причин боли в локте, например тендинит или артрит, ваш врач может помочь вам определить причину боли. И как только вам поставят диагноз, вы можете вместе с врачом начать процедуру снятия боли в локтевом суставе.

Отек обеих ног

Отек ступней, лодыжек и ног называется отеком.Это вызвано избытком жидкости, скопившейся в тканях. Из-за силы тяжести лишняя жидкость в теле оседает в нижней части. Вот почему больше всего страдают ноги и ступни.

Некоторые из причин отека включают:

• Заболевание сердца, такое как застойная сердечная недостаточность

• Длительное стояние или сидение

• Инфекция ступней или ног

• Кровь скопление в венах ног (венозная недостаточность), когда вены менее эластичны

• Расширенные вены на голени (варикозное расширение вен)

• Чулки или другая одежда, плотно прилегающая к ногам.Это вызовет скопление крови в ногах, потому что одежда ограничивает кровоток.

• Некоторые лекарства. К ним относятся некоторые гормоны, такие как противозачаточные таблетки, некоторые лекарства от артериального давления, такие как блокаторы кальциевых каналов, стероиды и некоторые антидепрессанты, такие как ингибиторы МАО и трициклики.

• Менструальный цикл, вызывающий задержку жидкости

• Многие виды заболеваний почек

• Печеночная недостаточность или цирроз печени

• Беременность.Некоторая припухлость — это нормально, но внезапное увеличение отека ног или увеличение веса могут быть признаком опасного осложнения беременности, называемого эклампсией.

• Плохое питание

• Заболевание щитовидной железы

Лечение будет зависеть от того, что вызывает отек ног. Ваш лечащий врач может прописать водные таблетки (диуретики), чтобы избавиться от лишней жидкости.

Уход на дому

При уходе за собой дома соблюдайте следующие правила:

• Не носите одежду, например чулки, которые плотно облегают ваши ноги.

• Лежа или сидя, держите ноги поднятыми.

• Если отек вызван инфекцией, травмой или недавней операцией, держитесь подальше от ног, пока симптомы не исчезнут.

• Если ваш лечащий врач утверждает, что отек ноги вызван венозной недостаточностью или варикозным расширением вен, не сидите и не стойте на одном месте в течение длительного времени. Делайте перерывы и гуляйте каждые несколько часов. Быстрая ходьба — хорошее упражнение. Это помогает циркулировать крови, скопившейся в ноге.Поговорите со своим врачом об использовании поддерживающих чулок, чтобы остановить отек ног в дневное время.

• Если ваш врач утверждает, что отек ноги вызван сердечным заболеванием, соблюдайте диету с низким содержанием соли, чтобы лишняя жидкость не оставалась в вашем теле. Вам также могут понадобиться лекарства.

Последующее наблюдение

Наблюдение за вашим лечащим врачом или в соответствии с рекомендациями.

Когда обращаться за медицинской помощью

Немедленно позвоните своему врачу, если произойдет что-либо из этого:

• Отек обеих ног или лодыжек, усиливающийся

• Отек живота

• Покраснение, тепло, или припухлость на одной ноге

• Лихорадка 100.4ºF (38ºC) или выше, или по указанию вашего лечащего врача

• Желтый цвет кожи или глаз

• Быстрое, необъяснимое увеличение веса

• Необходимость спать прямо или использовать большее количество подушек

Позвоните по телефону

Это самый быстрый и безопасный способ добраться до отделения неотложной помощи. При необходимости медработники также могут начать лечение по дороге в больницу.

Позвоните по телефону 911 или немедленно обратитесь за медицинской помощью, если номер

Yankees становится первым игроком современной эпохи, выигравшим титул ваттинга в каждой лиге

Инфилдер «Нью-Йорк Янкиз» DJ LeMahieu вошел в историю титула ватина.LeMahieu завоевал титул ватина Американской лиги в воскресенье и стал первым игроком современной эпохи, который выиграл титул ватин в каждой лиге. Ранее он выигрывал титул чемпиона Национальной лиги в составе команды «Скалистые горы» в 2016 году, набрав 0,348. LeMahieu лидировал MLB в среднем уровне оба раза.

«Ребята не выигрывают титулы ватин в обеих лигах, потому что вы выигрываете их в одной лиге, они, вероятно, удерживают вас», — сказал журналистам после субботней игры (NYY 11, MIA 4 ), включая Associated Press.«В наши дни это другая игра».

Современная эра начинается в 1900 году, и в то время член Зала славы Эд Делаханти выигрывал титулы ватин в каждой лиге. Делаханти выиграл титул ватин NL 1899 года с Philadelphia Phillies и титул ватина AL в 1902 году с вашингтонскими сенаторами, но титул ватина 1899 года оспаривается, следовательно, LeMahieu является первым в современную эпоху.

По словам исследователя YES Network Джеймса Смита, единственным другим игроком, выигравшим титул в нескольких официальных лигах, был Пит Браунинг.Он выиграл 1882 и 1885 американские титулы ватина Американской ассоциации с Луисвиллским затмением и титул Лиги игроков 1890 года с Кливлендскими младенцами.

LeMahieu, надвигающийся свободный агент, готовый получить значительную зарплату, является первым янки, выигравшим титул ватина с тех пор, как Берни Уильямс ударил 0,339 в 1998 году. Вот итоговая средняя таблица лидеров по ватку AL за 2020 год (для квалификации необходимо 186 выступлений на тарелках):

1. DJ LeMahieu, Yankees: .364
2. Тим Андерсон, White Sox: .322
3. Дэвид Флетчер, Ангелы: ,319
4. Хосе Абреу, Уайт Сокс: ,318

Андерсон (0,335) выиграл титул в прошлом году, а ЛеМахье (0,327) финишировал вторым. Это только седьмой раз в истории, когда одни и те же два игрока финишировали первым и вторым (в любом порядке) в гонке за титул ватин за несколько лет подряд, и впервые с тех пор, как это сделали Микки Мантл и Тед Уильямс в 1956 и 1957 годах.

Конечно, в этом году ЛеМахье завоевал титул ватина в необычном сезоне из 60 игр из-за пандемии COVID-19, поэтому его трудно рассматривать наравне с титулом ватина из 162 игр.Тем не менее, вы можете играть только по тому расписанию, которое вам дано, и каждая команда сыграла одинаковое количество игр. Это бейсбол 2020 года.

LeMahieu выиграл титул, а его товарищ по команде Yankees Люк Войт привел MLB с 22 хоумранами в этом году. Они являются первым набором товарищей по команде, которые возглавили лигу по среднему показателю и по хомерсам со времен Зала Славы Хэнка Аарона (0,355) и Эдди Мэтьюза (46 Хомерс) с «Брейвз» 1959 года, не считая одиночных игроков, которые лидировали в обеих категориях.

«Все хотят, чтобы этот год не был таким уж странным», — сказал Войт репортерам, в том числе Дэну Мартину из New York Post , в субботу.«Вы должны просто кататься с этим. Я сделал, что мог, в этом году».

В Национальной лиге аутфилдер Nationals Хуан Сото вытеснил первого игрока с низов Braves Фредди Фримена за титул ватина. Сото ударил 0,351, а Фриман — 0,341. Сото — первый игрок сборной, когда-либо выигравший титул ватина, и третий в истории франшизы, присоединившись к Элу Оливеру (0,331 в 1982 году) и Тиму Рейнсу (0,334 в 1986 году). Оливер и Рейнс сделали это в годы проведения выставок.

Оба на испанском языке | Перевод с английского на испанский

both [bəʊθ]

прилагательное

both (the) boys los dos or ambos chicos

местоимений

, оба они los dos; мы оба nosotros dos; los dos; мы оба пошли fuimos los dos

, они оба были там, они оба были там, setan allí los dos

наречие

она одновременно смеялась и плакала reía y lloraba a la vez; Я нахожу это одновременно впечатляющим и вульгарным encuentro que es impresionante y vulgar a la vez; он одновременно играет и поет canta y además toca; и ты, и я видели это lo vimos tanto tú como yo; lo vimos los dos

Когда и — местоимение или прилагательное, вы обычно можете перевести это, используя los / las dos :

Мы оба альпинисты, мы оба альпинисты Los dos somos alpinistas

Я знаю их обоих

Я знаю их обоих Los conozco a los dos

Обе сестры были слепыми Las dos hermanas eran ciegas

В качестве альтернативы, в более формальной речи, используйте ambos / ambas :

Нам обоим понравилось Nos gustó a ambos

Оба (этих) региона автономны Ambas regiones son autónomas

Не используйте артикул с ambos .

Оба … и могут быть переведены разными способами, в зависимости от того, на что идет ссылка. Если это относится к двум людям, вы обычно можете использовать неизменный tanto … como . В качестве альтернативы вы можете часто использовать los / las dos , хотя это может потребовать изменения синтаксиса:

И Мэри, и Питер будут здесь очень счастливы Tanto Mary como Peter van a ser muy felices aquí , Mary y Peter van a ser los dos muy felices aquí

И Майк, и Клэр видели, что что-то не так. Tanto Mike como Clare veían que algo iba mal

Когда говорят о двух группах или вещах, используйте tanto… como или, если и … и эквивалентно «одновременно», используйте a la vez :

Курс предназначен как для преподавателей фортепиано, так и для учителей скрипки. El curso está dirigido a profesores tanto de piano como de violín , El curso está dirigido a la vez a profesores de piano y de violín

Tanto … como также может использоваться с наречиями:

физически и ментально Era un hombre débil, tanto física como mentalmente

Когда наречия, оканчивающиеся на -mente , соединяются вместе, как здесь, только последнее сохраняет -mente .

Когда и …, и относятся к глаголам, обычно можно использовать y además :

Он и рисует, и лепит Pinta y además hace esculturas

Используйте a la vez , чтобы комментировать описания, которые оба верны одновременно:

Книга одновременно интересна и удручает El libro es interesante y deprimente a la vez

Изменения транс- и цис-регуляторных элементов опосредуют устойчивость к инсектицидам у чешуекрылых, Spodoptera exigua

Abstract

Развитие устойчивости насекомых к инсектицидам часто связано со сверхэкспрессией одного или нескольких генов фермента цитохрома P450.Хотя сверхэкспрессия генов CYP450 является хорошо известным механизмом устойчивости к инсектицидам, лежащие в основе механизмы регуляции плохо изучены. Здесь мы раскрыли механизмы сверхэкспрессии гена P450, CYP321A8 у основного насекомого-вредителя, Spodoptera exigua , устойчивого к множественным инсектицидам. CYP321A8 придает этому насекомому устойчивость к фосфорорганическим (хлорпирифос) и пиретроидным (циперметрин и дельтаметрин) инсектицидам. Конститутивная повышающая регуляция факторов транскрипции CncC / Maf частично ответственна за повышенную экспрессию CYP321A8 в устойчивом штамме.Анализы репортерного гена и анализы сайт-направленного мутагенеза показали, что CncC / Maf усиливает экспрессию CYP321A8 за счет связывания со специфическими сайтами в промоторе. Дополнительные регулирующие элементы цис , возникающие в результате мутации в промоторе CYP321A8 в устойчивом штамме, облегчают связывание орфанного ядерного рецептора, Knirps , и усиливают активность промотора. Эти результаты демонстрируют, что два независимых механизма; сверхэкспрессия факторов транскрипции и мутации в промоторной области, приводящие к появлению нового регулирующего элемента cis , который облегчает связывание орфанного ядерного рецептора, вовлечены в сверхэкспрессию CYP321A8 в инсектицидном S . exigua .

Информация об авторе

Насекомые-вредители, у которых развивается устойчивость к инсектицидам, используемым для борьбы с ними, является серьезной проблемой в сельском хозяйстве. Многие вредители, в том числе совка совка, Spodoptera exigua , выработали устойчивость к инсектицидам, используемым для борьбы с ними. Информация о механизмах сопротивления поможет в программах управления сопротивлением. Избыточная экспрессия детоксифицирующих ферментов была связана с устойчивостью к инсектицидам, но их функции и механизмы регулирования до сих пор не определены.Уровни экспрессии генов P450 между чувствительными и устойчивыми штаммами S . exigua были сравнены, и CYP321A8 был идентифицирован как основной фактор устойчивости к фосфорорганическим инсектицидам и пиретроидным инсектицидам. Дальнейшие исследования выявили два независимых, но синергетических механизма; конститутивная повышающая регуляция факторов транскрипции b-Zip и мутации в промоторе, который облегчает связывание орфанного ядерного рецептора, Knirps , способствующий увеличению экспрессии CYP321A8 и устойчивости к множественным инсектицидам в S . exigua .

Образец цитирования: Hu B, Huang H, Hu S, Ren M, Wei Q, Tian X и др. (2021) Изменения транс- и цис-регуляторных элементов опосредуют устойчивость к инсектицидам у вредителя лепидоптерона, Spodoptera exigua . PLoS Genet 17 (3): e1009403. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403

Редактор: Джон Эвер, Университет Вальпараисо, ЧИЛИ

Поступило: 20 июля 2020 г .; Принят в печать: 9 февраля 2021 г .; Опубликован: 9 марта 2021 г.

Авторские права: © 2021 Hu et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все регистрационные номера генов доступны в Генном банке (регистрационные номера MK327547 и MK327548).

Финансирование: Работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (№ 32000333) и Китайским фондом постдокторантуры (2020M671264) в BH.Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№32072452) и Провинциальной программой ключевых исследований и разработок Цзянсу (BE2019396) для JS. Проект финансировался Европейским исследовательским советом в рамках программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 (№ 646625) для CB. Проект поддержан Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, проектом HATCH 2351177000 и Конкурсным грантом Инициативы по исследованиям в области сельского хозяйства и пищевых продуктов No.2019-67013-29351 к SRP. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

У насекомых часто развивается устойчивость к инсектицидам, которые используются для борьбы с ними. Это микроэволюционное изменение в ответ на экологические проблемы представляет собой постоянную битву между насекомыми и людьми [1–3].Устойчивость к инсектицидам у насекомых вырабатывается множеством механизмов; усиленная детоксикация инсектицидами (метаболическая устойчивость) и нечувствительность к участкам-мишеням (устойчивость к участкам-мишеням) являются одними из основных механизмов. Ферменты цитохрома P450 (P450), которые способны метаболизировать синтетические инсектициды и растительные соединения, включая токсины, играют важную роль в метаболической устойчивости [4]. Было показано, что сверхэкспрессия генов, кодирующих P450s, связана с устойчивостью к инсектицидам у широкого круга видов насекомых [5-8].Например, сверхэкспрессия CYP6G1 придает устойчивость к инсектицидам ДДТ и имидаклоприду у Drosophila melanogaster [9].

Мутации в цис- -регуляторных элементах в промоторных областях генов P450 и / или изменения уровня экспрессии факторов транскрипции, связывающихся с этими -цис- -регуляторными элементами, могут вносить вклад в усиленную экспрессию генов P450 [10–14]. Мутации в цис--действующих элементах в промоторах P450, как было показано, вызывают конститутивную сверхэкспрессию генов P450 [2,15–18].В D . melanogaster , активация гена CYP6G1 является результатом вставки TE в промоторную последовательность [3,19]. Известно, что члены суперсемейства ядерных рецепторов (NR), основной лейциновой молнии (bZIP) и основной спирали-петля-спираль / per-ARNT-SIM (bHLH-PAS) опосредуют устойчивость к инсектицидам [20]. У членистоногих конститутивная избыточная экспрессия ядерных рецепторов / факторов транскрипции, принадлежащих к этим суперсемействам, способствует увеличению экспрессии P450, ответственных за метаболическую устойчивость.Повышение экспрессии ядерного рецептора FTZ-F1 в Plutella xylostella вызывает сверхэкспрессию CYP6BG1 , который метаболизирует хлорантранилипрол [21]. Точно так же арилуглеводородный рецептор (AhR), принадлежащий к семейству белков bHLH-PAS [20], регулирует CYP6DA2 в Aphis gossypii , обеспечивая толерантность к госсиполу и спиротетрамату [22]. Гетеродимерные факторы транскрипции bZIP Nrf2 и Maf играют важную роль в регуляции генов детоксикации, связанных с окислительным или ксенобиотическим ответом у людей [23]. CncC , ортолог насекомых Nrf2 вместе с его гетеродимерным партнером, Maf-S также регулируют экспрессию генов детоксикации, связанных с метаболизмом ксенобиотиков, включая инсектициды и химические вещества растений [24,25]. Например, эти факторы транскрипции контролируют сверхэкспрессию генов P450 в D . melanogaster [26], устойчивые к инсектицидам. Несмотря на растущее понимание роли изменений в цис--действующих и -транс--действующих элементах в регуляции генов устойчивости к P450, относительная важность этих двух механизмов и то, действуют ли они в основном изолированно или в комбинации, остается плохо изученной.

Spodoptera exigua — всемирный вредитель, который наносит серьезный ущерб многим культурам [27] и выработал устойчивость к 38 инсектицидам [28]. Эта работа проводилась для изучения молекулярных основ устойчивости этого вида к фосфорорганическим инсектицидам и пиретроидным препаратам. Мы обнаружили, что комбинация факторов, действующих на цис, и транс, , действует в тандеме, регулируя цитохром P450, что приводит к устойчивости к множественным инсектицидам.

Результаты

Устойчивость к инсектицидам связана со сверхэкспрессией P450,

Для изучения взаимосвязи между CYP450 и устойчивостью к инсектицидам в S . exigua , биоанализ и анализ ферментативной активности. По сравнению с восприимчивым штаммом устойчивый штамм проявлял 935, 563 и 305-кратную устойчивость к хлорпирифосу, циперметрину и дельтаметрину (таблица S1). Биологические анализы показали, что ингибитор P450, пиперонилбутоксид (PBO) значительно усиливает токсичность хлорпирифоса, циперметрина и дельтаметрина в устойчивом штамме (синергетические отношения 8,1, 3,6 и 3,0 соответственно) (таблица S1). Напротив, PBO не проявлял синергетического эффекта в чувствительном штамме.Биохимическое измерение активности P450 с использованием модельного флуоресцентного субстрата 7-этоксикумарина выявило значительно более высокую активность P450 в устойчивом штамме (в 2,93 раза, значение p <0,05) по сравнению с чувствительным штаммом (рис. 1A). Эти результаты предполагают, что устойчивость к хлорпирифосу, циперметрину и дельтаметрину может быть связана с повышенной активностью P450 в устойчивом штамме. Поэтому в этом исследовании мы сосредоточимся на взаимосвязи между CYP450 и устойчивостью к инсектицидам, а GST и EST будут сообщаться отдельно.

Рис. 1. Избыточная экспрессия CYP321A8 придает устойчивость ко многим инсектицидам в S . exigua .

(A) Активность P450 у личинок чувствительных и устойчивых штаммов S . exigua . Активность монооксигеназы P450 оценивали путем измерения активности этоксикумарин-O-деэтилазы (ECOD). Значительная разница в ферментативной активности обозначена звездочкой (t-критерий Стьюдента, p <0,05). Планки погрешностей указывают на SD.(B) Относительная экспрессия генов P450 в чувствительных и устойчивых штаммах S . exigua , как определено с помощью RT-qPCR. Планки погрешностей отображают SD. Существенная разница в экспрессии между чувствительными и устойчивыми штаммами обозначена звездочкой (ANOVA с post-hoc HSD Тьюки, p <0,05). Чувствительность трансгенного D . melanogaster на хлорпирифос (C), циперметрин (D) и дельтаметрин (E). Планки погрешностей отображают SD. Значительные различия в смертности между линиями, экспрессирующими CYP321A8, и контрольными мухами без трансгена указаны с помощью звездочки (t-критерий Стьюдента, p <0.05). (F) Метаболическая активность рекомбинантного фермента CYP321A8 против модельного флуоресцентного субстрата. Показана скорость O-деалкилирования 7-этоксикумарина (ECOD). Планки погрешностей отображают SD. Метаболизм хлорпирифоса (G), циперметрина (H) и дельтаметрина (I), метаболизм рекомбинантным CYP321A8. Планки погрешностей отображают значения стандартного отклонения. Значимые различия (p <0,05) в метаболизме обозначены буквами над столбцами (ANOVA с post-hoc HSD Тьюки).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403.g001

Чтобы идентифицировать P450, участвующие в устойчивости, мы проанализировали уровень экспрессии 68 P450 между устойчивыми и чувствительными штаммами (рис. 1B). Двадцать один из них (30% проанализированных генов) показал более чем двукратную повышающую регуляцию (значение p <0,05) в устойчивом штамме, что позволяет предположить, что несколько P450 могут способствовать устойчивости к инсектицидам в S . exigua . Однако среди них CYP321A8 особенно сильно экспрессировался в устойчивом штамме (в 306 раз выше).По этой причине последующие исследования молекулярных механизмов, ответственных за сверхэкспрессию гена P450 в устойчивом штамме, были сосредоточены на CYP321A8 .

Избыточная экспрессия

Чтобы определить, является ли повышающая регуляция CYP321A8 достаточной для придания устойчивости к инсектицидам, штамм Act5C-GAL4 и систему GAL4 / UAS использовали для экспрессии CYP321A8 (Act5C-CYP321A8) в трансгенном D . melanogaster . ОТ-ПЦР (S1A фиг.) И RT-qPCR (S1B фиг.) Использовали для подтверждения уровня экспрессии CYP321A8 в потомстве F ₁ . Когда насекомых, экспрессирующих CYP321A8, обрабатывали 0,05 ppm хлорпирифоса в течение 3 дней, наблюдалась 47% смертность по сравнению со 100% смертностью у контрольных насекомых (рис. 1C). Точно так же воздействие циперметрина 0,6 ppm и дельтаметрина 0,4 ppm в течение 3 дней убивало 55% и 45% насекомых, экспрессирующих CYP321A8 , соответственно, по сравнению со 100% и 84% смертностью в контроле (рис. 1D и 1E).Эти данные демонстрируют, что гиперэкспрессия CYP321A8 достаточна для придания устойчивости ко всем трем испытанным инсектицидам. Чтобы дополнительно доказать, что CYP321A8 может метаболизировать эти инсектициды, CYP321A8 и Helicoverpa armigera цитохром P450 редуктаза ( CPR ) коэкспрессировались в клетках Sf9. Вестерн-блоттинг и тесты с уменьшенным спектром CO-разности подтвердили, что CYP321A8 успешно экспрессировался как функциональный фермент CYP450 (S2A и S2B фиг.).Кроме того, оценка каталитической активности рекомбинантного CYP321A8 с использованием модельного субстрата ECOD показала удельную активность 0,68 пмоль / мин / пмоль белка, подтверждая, что рекомбинантный CYP321A8 является каталитически активным (рис. 1F). Способность рекомбинантного CYP321A8 к метаболизму инсектицидов оценивалась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). После инкубации в течение 1,5 ч в присутствии НАДФН, 51,9 ± 3,8% и 72,1 ± 9,0% хлорпирифоса (рис. 1G), 18,8 ± 2,4% и 33,4 ± 3.0% циперметрина (рис. 1H) и 24,2 ± 2,8% и 37,7 ± 4,1% дельтаметрина (рис. 1I) метаболизировались 100 и 200 мкг CYP321A8 соответственно. Не было обнаружено снижения содержания этих инсектицидов в рекомбинантном CYP321A8, который инкубировали без НАДФН. Белки, собранные из контрольных клеток Sf9, показали лишь следовые уровни метаболизма этих инсектицидов. Взятые вместе, эти in vivo и in vitro функциональные анализы демонстрируют, что CYP321A8 может придавать устойчивость к хлорпирифосу, циперметрину и дельтаметрину.

Конститутивная сверхэкспрессия

В качестве первого шага к идентификации молекулярных механизмов, лежащих в основе сверхэкспрессии CYP321A8 в устойчивом штамме, был проведен анализ in silico предполагаемой промоторной последовательности этого гена. Прогностическая аналитика сайтов связывания TF (рис. 2A) показала сайты связывания для CncC / Maf , Hb ( Hunchback ), Dfd ( Deformed ), P53 , CREB (циклин AMP-элемент-ответ связывающий белок) , EcR (рецептор экдизона) , BR-C (широкий комплекс) , XBP-1 (X-бокс-связывающий белок 1), связывание GATA, Dl ( дорсальный ) и Кр (Крюппель) .Анализ уровней экспрессии TF, которые связываются с этими предсказанными сайтами с помощью RT-qPCR, показал, что гены CncC и Maf были значительно сверхэкспрессированы (в 5,2 и 2,8 раза соответственно) в устойчивом штамме (рис. 2B). Однако нет значительных различий в экспрессии CREA , CREB , Dfd , P53 , Dorsal-A , USP , Dorsal-B , EcR , BR-C , BR-C и Kr, наблюдались между двумя штаммами.Чтобы проверить, усиливает ли CncC / Maf экспрессию CYP321A8 в устойчивом штамме, открытые рамки считывания этих двух генов лигировали в экспрессионную плазмиду и котрансфицировали фрагментом 1900 п.н. предполагаемого CYP321A8 . промотор лигировали в вектор репортерного гена. Maf незначительно увеличивал активность промотора CYP321A8 (в 1,41 раза, значение p = 0,052), а CncC значительно улучшал активность промотора. Дальнейшее увеличение было обнаружено в присутствии как CncC, так и Maf (рис. 2C).Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что конститутивная сверхэкспрессия CncC и Maf приводит к увеличению уровней мРНК CYP321A8 .

Рис. 2. Избыточная экспрессия CncC и Maf увеличивает промоторную активность CYP321A8 .

(A) Прогнозирование сайтов связывания факторов транскрипции в области ~ 2 т.п.н. промотора гена CYP321A8 . Нуклеотиды пронумерованы относительно сайта начала трансляции (ATG), обозначенного +1.Предполагаемые сайты связывания для сайтов факторов транскрипции подчеркнуты. Предполагаемый сайт инициации транскрипции (Inr) подчеркнут. (B) Относительная экспрессия факторов транскрипции в чувствительных и устойчивых штаммах S . exigua , как определено с помощью RT-qPCR. Планки погрешностей отображают SD. Существенная разница (p <0,05) в экспрессии между штаммами Sus и Res обозначена звездочкой (ANOVA с post-hoc HSD Тьюки). (C) Люциферазная активность в клетках, трансфицированных репортерной конструкцией (ген люциферазы находится под контролем промотора CYP321A8) и CncC или Maf, а также экспрессирующими конструкциями CncC и Maf.Различные буквы над столбиками указывают на значительные различия, основанные на ANOVA с последующим post-hoc HSD Тьюки (p <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403.g002

Для дальнейшего определения сайтов связывания CncC / Maf в промоторной области CYP321A8 были приготовлены конструкции усечения промотора (рис. 3A). Полноразмерное усечение содержит два сайта связывания CncC / Maf . Т1 и Т3 содержат только первый и второй сайтов связывания CncC / Maf соответственно.Сайты связывания CncC / Maf не были представлены в перекрестке Т2, а усеченный Т4 содержит только коровой промотор. Активность полноразмерного промотора (Full), усечений от -1941 до -1817 пар оснований (T1) и от -385 до -1 (T3) была увеличена в 4,71, 3,85 и 5,97 раза соответственно с помощью CncC / Maf (рис. 3Б). Напротив, CncC / Maf не оказывал значительного влияния на активность усечения промотора от -1840 до -361 п.н. (Т2) или усечения, содержащего только коровой промотор (Т4). Эти данные предполагают, что усеченные промоторы Т1 и Т3 содержат сайты связывания CncC / Maf.Эти результаты подтвердили анализ in silico, который предсказал два предполагаемых сайта связывания CncC / Maf (AATGACTTTGCAGTT и CATGACTCAGCAAAA), расположенных в усеченных точках T1 и T3 соответственно. Чтобы подтвердить, что эти участки последовательности содержат настоящих сайтов CncC / Maf, мы ввели мутации в промотор CYP321A8 в этих положениях, используя сайт-направленный мутагенез (рис. 4A). В конструкции M-11 первый сайт связывания CncC и Maf AATGACTTTGCAGTT был заменен на AAgactTTTttcGTT, а второй сайт не был изменен.В M-12 второй сайт связывания CncC и Maf CATGACTCAGCAAAA был заменен на CAgactTCAttcAAA, и первый сайт остался нетронутым. Между тем, оба этих сайта были мутированы в M-13. В WT-2 присутствует только первый сайт AATGACTTTGCAGTT, и он был заменен на AAgactTTTttcGTT в конструкции M-2. Мутированная конструкция M-3 (CAgactTCAttcAAA) была получена из WT-3, содержащего только второй сайт (CATGACTCAGCAAAA). По сравнению с конструкцией WT-1 дикого типа, промоторная активность мутантных конструкций M-11, M-12 и M-13 была значительно снижена (фиг. 4B).Точно так же активность М-2 была значительно ниже, чем у контрольного WT-2 дикого типа. По сравнению с конструкцией WT-3 промоторная активность мутированного M-3 была снижена. Таким образом, эти результаты подтверждают, что оба сайта связывания CncC и Maf играют важную роль в активации промотора CYP321A8 .

Рис. 3. CncC и Maf регулируют экспрессию CYP321A8 путем связывания с проксимальными и / или дистальными участками.

(A) Схематическое изображение делеций промотора CYP321A8 .(B) Анализ активности делеций промотора CYP321A8 в анализах репортерного гена в присутствии и в отсутствие CncC / Maf. Активность люциферазы нормализовали с активностью люциферазы Renilla. Планки погрешностей отображают SD. Полноразмерный промотор и каждую усеченную версию сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента. Значимые различия (p <0,05) в активности люциферазы отмечены звездочкой.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403.g003

Рис. 4. Мутации в сайтах связывания CncC / Maf отменяют способность этих факторов транскрипции индуцировать экспрессию CYP321A8 .

(A) Схематическое изображение мутировавших конструкций промотора CYP321A8 . (B) Активность этих конструкций в репортерных анализах. Планки погрешностей указывают на SD. Активность каждой мутированной конструкции сравнивали с соответствующим контролем дикого типа с помощью t-критерия Стьюдента и значимых различий (p <0.05) отмечены звездочкой.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403.g004

Мутация, действующая на цис-

Рис. 5. Мутация, действующая на цис- в промоторе CYP321A8 , усиливает экспрессию этого гена P450 в устойчивом штамме S . exigua .

(A) Филогенетическая взаимосвязь промоторных последовательностей CYP321A8 , полученных из чувствительных и устойчивых штаммов. Филогенез был выведен на основе максимального правдоподобия, и отображаются процентные значения начальной загрузки из 1000 повторов. (B) Анализ активности устойчивого промотора CYP321A8 (ДНК5’-R) и чувствительного промотора (ДНК5’-S). Планки погрешностей отображают SD. Буквы над столбиками обозначают значительную разницу при p <0,05 (ANOVA с апостериорным методом Tukey HSD).(C) Активность конструкций с прогрессирующей 5 ’делецией промотора CYP321A8 . Планки погрешностей отображают SD. Буквы справа от столбцов обозначают значимое различие при p <0,05 (ANOVA с апостериорным методом Tukey HSD). (D) Активность прогрессивных конструкций с 5’-делециями от -522 до -142 промотора CYP321A8 из чувствительных и устойчивых штаммов. Планки погрешностей отображают SD. Буквы справа от столбцов обозначают значимое различие при p <0,05 (ANOVA с апостериорным методом Tukey HSD).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403.g005

Рис. 6. Мутация, действующая на cis в промоторе CYP321A8 резистентного штамма, способствует связыванию ядерного рецептора Knirps и способствует усилению регуляции из CYP321A8 .

(A) Выравнивание области промотора CYP321A8 устойчивого и чувствительного штаммов. Мутации в пяти позициях указаны над выравниванием. (B) Активность мутантных конструкций промотора CYP321A8 из устойчивого штамма, где мутации в области от -385 до -142 были возвращены к дикому типу.Планки погрешностей отображают SD. Буквы справа от столбцов обозначают значимое различие при p <0,05 (ANOVA с апостериорным методом Tukey HSD). (C) Активность промоторных конструкций P (-385 / -1) S (чувствительный штамм) и P (-385 / -1) R (устойчивый штамм) в анализах репортерных генов в присутствии и в отсутствие Knirps. PIB представляет собой пустой вектор pIB / V5-His. Планки погрешностей отображают SD. Буквы над столбиками обозначают значительную разницу при p <0,05 (ANOVA с апостериорным HSD Тьюки). (D) Относительная экспрессия Knirps в чувствительных и устойчивых штаммах S . exigua , как определено с помощью RT-qPCR. Планки погрешностей отображают SD. (E) Активность промоторных конструкций (ДНК5’-R и ДНК5’-S) в присутствии и в отсутствие конструкций CncC / Maf . Планки погрешностей отображают SD. Буквы над столбиками обозначают значительную разницу при p <0,05 (ANOVA с апостериорным методом Tukey HSD).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403.g006

Чтобы определить, координирует ли сверхэкспрессия trans -действующих факторов CncC / Maf и действующая мутация cis- в промоторе экспрессию CYP321A8 , конструкции, экспрессирующие CncC / Maf и kn и конструкции промотора CYP321A8 с сайтом связывания Knirps или без него котрансфицировали в клетки Sf9.Экспрессия CncC / Maf значительно увеличивала активность обеих конструкций промотора CYP321A8 с сайтом связывания Knirps и без него (значение p <0,05) (фиг. 6E). Однако гораздо более высокий уровень репортерной активности (41-кратный, значение p <0,05) наблюдался в клетках, трансфицированных экспрессионными конструкциями CncC / Maf вместе с конструкцией, содержащей сайт связывания Knirps, по сравнению с активностью промотора. конструкция без сайта связывания Knirps.Действительно, наблюдаемое повышение репортерной активности (в 41 раз больше, чем у промотора дикого типа в отсутствие CncC / Maf) было намного больше, чем сумма индивидуальных эффектов мутации, действующей на цис и CncC / Сверхэкспрессия Maf (9,1 + 4,7 раза) выявляет синергетическое взаимодействие между этими двумя механизмами. Эти данные ясно демонстрируют, что эти транс, — и цис -действующие элементы действуют синергетически, повышая регуляцию CYP321A8 в устойчивом штамме.

Обсуждение

Многочисленные исследования продемонстрировали важность цитохрома Р450 в обеспечении устойчивости к инсектицидам у многих видов насекомых и клещей [10]. Большинство этих исследований было сосредоточено на роли P450 в придании устойчивости к одному инсектициду или нескольким инсектицидам, принадлежащим к тому же классу. Здесь мы показываем, что CYP321A8 может способствовать устойчивости к нескольким инсектицидам, принадлежащим к разным химическим классам. Тот факт, что CYP321A8 метаболизирует два пиретроидных инсектицида (дельтаметрин и циперметрин) и органофосфат хлорпирифос, которые имеют очень разные химические структуры, предполагает, что этот P450 может быть важным универсальным ферментом, который защищает S . exigua из ряда ксенобиотиков. Соответствующие метаболиты будут идентифицированы дополнительно. Всего несколько предыдущих исследований однозначно идентифицировали P450, способные метаболизировать структурно различные инсектициды, принадлежащие к разным классам по способу действия. В D . melanogaster , сверхэкспрессия CYP6G1 , как было показано, придает устойчивость к четырем неродственным инсектицидам (диазинон, нитенпирам, луфенурон и ДДТ) [1,29]. Точно так же CYP6CM1 из Bemisia tabaci может детоксифицировать несколько неоникотиноидных инсектицидов и блокатор питания пиметрозин [30,31].Наконец, CYP6M2 сверхэкспрессируется в устойчивых популяциях A . gambiae , может метаболизировать пиретроиды, карбамат и ДДТ трех различных химических классов [32]. Вместе с результатами нашего исследования эти результаты демонстрируют замечательную гибкость насекомых P450 в метаболизме химически разнообразных инсектицидных субстратов.

В то время как способность P450s метаболизировать инсектициды для защиты насекомых от инсектицидов хорошо известна, то, как именно регулируются P450, которые чрезмерно экспрессируются у устойчивых насекомых, изучено значительно хуже.В текущем исследовании мы показали, что факторы транскрипции CncC / Maf сверхэкспрессируются и связываются с двумя элементами ответа ксенобиотиков (XRE) из промотора CYP321A8 в устойчивом штамме. В нескольких предыдущих исследованиях по этой теме также сообщалось о конститутивной сверхэкспрессии этих факторов транскрипции у устойчивых к инсектицидам штаммов членистоногих. Например, было обнаружено, что CncC / Maf сверхэкспрессируется в штамме Tetranychus cinnabarinus с устойчивостью к фенпропатрину и контролировал усиленную экспрессию CYP392A28 , CYP391B1 и приводили к устойчивости к CYP391B1 и , что приводило к устойчивости к CYP391B1 и . ].Аналогичным образом было показано, что CncC активируется в резистентном к дельтаметрину T . castaneum и служат важным регулятором множества P450, принадлежащих к подсемейству CYP6BQ, которые придают устойчивость к дельтаметрину [34]. Также было обнаружено, что CncC и Maf связаны с цис--регуляцией CYP6P9a и CYP6P9b в переносчике малярии Anopheles funestus [17,18]. Наконец, CncC и Maf регулируют сверхэкспрессию четырех генов P450, участвующих в устойчивости к имидаклоприду в L . decemlineata [35]. Эти исследования вместе с нашими результатами ясно демонстрируют важную роль CncC / Maf как транс- -регуляторов генов P450 у членистоногих. Более того, как предполагалось в предыдущих исследованиях, их конститутивная сверхэкспрессия у устойчивых членистоногих может приводить к изменениям в экспрессии нескольких P450. Наши результаты согласуются с этим, в котором 30% протестированных P450 активировали резистентный штамм. В совокупности эти данные предполагают, что конститутивная сверхэкспрессия CncC / Maf может обеспечить механизм для членистоногих вредителей, чтобы более быстро развить устойчивость к инсектицидам.В частности, за счет увеличения экспрессии нескольких P450 шансы активировать P450, который обладает способностью метаболизировать инсектицид, значительно повышаются. Напротив, эта стратегия может иметь более высокие затраты на приспособленность, чем механизм действия цис- из-за ее воздействия на несколько генов, сверхэкспрессия которых повлечет за собой метаболические затраты. Мутации, приводящие к конститутивной сверхэкспрессии CncC и Maf в S . exigua и описанные выше виды членистоногих не идентифицированы.Учитывая сохранение этого механизма у ряда устойчивых членистоногих, характеристика генетических изменений, ведущих к усилению активности этих факторов транскрипции, должна стать приоритетом будущих исследований. В этом исследовании было идентифицировано сайтов связывания CncC / Maf . В сочетании с предыдущими исследованиями [34], эти данные приближают нас к пониманию консенсусных мотивов, с которыми связываются эти важные факторы транскрипции, и степени их изменчивости у насекомых.Такие знания важны, поскольку они повышают точность предсказания in silico сайтов связывания этих факторов транскрипции, а также P450, которые могут ими регулироваться.

В дополнение к характеристике роли этих важных факторов, действующих на trans, , в регуляции CYP321A8 , мы также идентифицировали мутацию, действующую на cis в устойчивом S . exigua , что способствовало увеличению экспрессии этого гена P450.Хотя вставки / делеции или мутации в промоторной области часто участвуют в фенотипах устойчивости, которые сверхэкспрессируют ген, кодирующий детоксифицирующий фермент, лишь в нескольких исследованиях это подробно проанализировано. Например, простая нуклеотидная замена, расположенная рядом с сайтом начала транскрипции CYP9M10 , увеличивала транскрипцию этого гена в Culex quinquefasciatus [36]. У Myzus persicae экспансия динуклеотидного микросателлита в промоторной области привела к сверхэкспрессии CYP6CY3 , что придает устойчивость к неоникотиноидным инсектицидам и никотину [37].Множественные мутации в промоторе CYP6FU1 усиливали его экспрессию, что приводило к устойчивости к дельтаметрину у Laodelphax striatellus [38]. Наконец, изменения цис--регуляторных элементов вызывают сверхэкспрессию CYP6P9a и CYP6P9b, связанную с устойчивостью к пиретроиду в главном переносчике африканской малярии An . funestus [17,18]. Несмотря на важную информацию, предоставленную этими исследованиями, специфический активатор (ы) транскрипции, который действует согласованно с мутациями, действующими на цис , не был идентифицирован.Напротив, в этой статье мы демонстрируем, что мутация в промоторе CYP321A8 устойчивого S . exigua активирует этот ген P450, создавая сайт связывания для ножек ядерного рецептора. Эти результаты расширяют фундаментальные знания о том, как мутация в промоторе гена P450 позволяет связывать ядерный рецептор, который способствует сверхэкспрессии этого гена. Кроме того, выявление мутации в устойчивом штамме по сравнению с чувствительным штаммом S . exigua также имеет прикладное значение. В частности, его можно использовать в качестве маркера для определения частоты и распределения устойчивости, вызываемой этим механизмом, и, таким образом, информировать о стратегиях управления устойчивостью [17,18]. У насекомых ген knirps кодирует орфанный рецептор ядерного гормона, который играет жизненно важную роль во время его роста и развития [39–42]. Здесь мы обнаружили, что он может регулировать экспрессию гена P450 в S . exigua . Филогенетический анализ данных о последовательностях показал, что чувствительная последовательность A8-S4 собрана в кладу устойчивых последовательностей, что может быть результатом генетического разнообразия, но в A8-S4 отсутствует сайт связывания knirps.

Относительная важность цис — и / или транс -действующих факторов в регуляции P450, связанных с устойчивостью, и как эти механизмы взаимодействуют, неясно. В этом исследовании мы демонстрируем, что конститутивная повышающая регуляция CncC и Maf действует в сочетании с мутацией, действующей на цис , в промоторе CYP321A8 , вызывая его сверхэкспрессию в устойчивом штамме (рис. 7). В этом отношении наши результаты совпадают с результатами предыдущих отчетов, которые предполагали, что как цис--, так и -транс--действующие факторы могут действовать вместе, увеличивая экспрессию P450, которые вносят вклад в устойчивость.Вставка из 15 п.н., которая нарушает сайт связывания репрессора транскрипции mdGfi-1 в промоторе CYP6D1 , увеличивает экспрессию гена CYP6D1 примерно в 10 раз в устойчивом к пиретроиду штамме комнатной мухи [43]. Дальнейшие исследования показали, что экспрессия CYP6D1 также регулируется trans -действующим фактором, кодируемым геном, расположенным на хромосоме 2, однако этот фактор не был идентифицирован [44]. Точно так же интактный сайт связывания Nrf2 / Maf и неизвестный транс-действующий фактор на хромосоме 3 приводят к конститутивной сверхэкспрессии CYP6A2 , участвующего в устойчивости к ДДТ в D . melanogaster [13,26,45]. Хотя эти исследования показывают, что регуляция генов устойчивости с помощью комбинации как цис- — так и транс -действующих факторов может быть более распространенной, чем предполагалось ранее, точно, как эти факторы взаимодействуют, чтобы модулировать экспрессию гена P450, остается неясным. Наши данные предоставляют новую информацию по этому вопросу, поскольку показывают, что действующие факторы цис и транс оказывают синергетическое действие на экспрессию CYP321A8 в устойчивом к хлорпирифосу штамме S . exigua . Эти сайты связывания TF будут дополнительно идентифицированы в образцах, собранных в полевых условиях. Поскольку совокупный эффект этих регуляторных факторов намного больше, чем сумма их индивидуальных эффектов, эволюция обоих механизмов обеспечит лучшую пригодность для S . exigua в присутствии инсектицида.

Рис. 7. Схема регуляции CYP321A8 цис — и тран s-действующими факторами.

В резистентном штамме конститутивная сверхэкспрессия trans -действующих факторов CncC и Maf действуют в сочетании с цис--действующей мутацией в промоторе CYP321A8 , что облегчает связывание ядерного рецептора, Knirps, усиливая экспрессию CYP321A8 , что приводит к устойчивости к инсектицидам.В чувствительном штамме CncC и Maf экспрессируются на более низких уровнях, и у Knirps нет сайта связывания, поэтому экспрессия CYP321A8 низкая, что делает их восприимчивыми к инсектицидам.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403.g007

В заключение мы определили два независимых механизма (конститутивная сверхэкспрессия факторов транскрипции b-Zip и мутация в промоторе P450, создающая цис-регуляторный элемент cis ). который способствует связыванию ядерного рецептора), которые работают совместно, увеличивая экспрессию гена P450 и повышая устойчивость к инсектицидам у основных вредителей.Информация о механизмах метаболической устойчивости может помочь понять развитие устойчивости к инсектицидам у других вредителей и внести вклад в программы, направленные на борьбу с устойчивостью к инсектицидам.

Материалы и методы

Штаммы насекомых

Устойчивый к хлорпирифосу штамм S . exigua было собрано с Welsh Onion, Allium fistulosum , в Хуэйчжоу, провинция Гуандун, Китай, и с чувствительного штамма S . exigua был получен от Wuhan Kernel Bio-pesticide Company, Хубэй, Китай. Личинок выращивали на искусственном питании при температуре 25 ° C в условиях фотопериода 16 часов света / 8 часов темноты и относительной влажности 60 ± 5% [46].

Инсектициды

Циперметрин (96,5% TG), дельтаметрин (98% TG) и хлорпирифос (96,5% TG) были приобретены у компаний Jiangsu Yangnong, Nanjing Red Sun и Nanjing Keweibang Co., Ltd соответственно.

Токсикологические биотесты и анализы синергизма

Метод окунания листьев использовался для определения токсичности инсектицидов для S . exigua , как описано ранее [46]. Для каждой обработки требовалось, по крайней мере, 30 3 ^rd личинок-звёзд, и анализы повторяли трижды. Предварительные эксперименты были проведены для определения дозы синергистов, которые не оказали вредного воздействия на личинок 3-го возраста. 100 мг / л PBO не влияли на выживаемость личинок, и поэтому эту концентрацию использовали в анализах синергизма. Коэффициент синергизма был получен путем анализа различий между LC ₅₀ одного инсектицида и LC ₅₀ инсектицида с синергистом.

Извлечение ДНК и РНК